薛浩 后軍

骨結合是種植體穩(wěn)定和長久的基礎。對種植體表面進行處理是增加骨結合的有效手段。隨著3D打印技術的迅速發(fā)展，可以個性化設計出具有特殊表面結構的植體，并個性化打印。3D打印多孔鈦種植體表面具有均勻可控的多孔結構，同時，成型精度高、重復性好和具有良好的機械性能。海藻酸鈉（SA）是從天然褐藻里提取的一種多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，SA溶液遇到二價的金屬離子會生成凝膠，經過凍干技術可形成具有三維結構的支架[1]。通過將無機生物材料摻入到SA支架中可有效克服其機械性能差的缺陷，羥基磷灰石（HA/HAP，以下均簡寫為HA）是人體硬組織（骨和牙齒）的無機相成分，HA材料能夠模仿骨的天然胞外基質并促進骨和軟骨細胞的粘附，具有良好的生物相容性和骨傳導性[2]。

本研究中，在3D打印多孔鈦表面均勻孔隙中加載SA/HA復合微支架結構，然后經體內動物實驗和CBCT掃描，通過對這種復合支架結構周圍骨密度值的測量分析，研究這種特殊支架結構對成骨的影響。

資料與方法

1多孔鈦制備和分組

使用SolidWorks2016軟件設計有孔試件的三維模型（參數：直徑D=10mm，高度H=2mm，內孔直徑d=500μm，高度h=1mm）。選擇性激光燒結制備出試件60枚，其中無孔鈦片20枚（對照組，記作NPO組），有孔鈦片40枚，有孔鈦片中隨機選取20枚作為多孔組（陰性對照組，記作PO組），剩下20枚作為加載組（實驗組，記作LPO組）。三組分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲震蕩各15分鐘，干燥備用。

2加載SA/HA微支架

首先，取3.0gSA粉末在70℃去離子水中溶解成溶液，稱取1.0g緩釋劑一（乙二胺四乙酸二鈉鈣）溶解在SA溶液中，置于攪拌機中均勻攪拌1小時。加入1.0gHA粉末（SA：HA=3:1），均勻混合攪拌1小時。最后，加入緩釋劑二（葡萄糖酸內酯）1.0g，攪拌均勻后，將所得混合物均勻覆蓋在載有LPO組鈦試件的孔板中，然后，將孔板迅速置于真空壓力泵中，真空狀態(tài)下持續(xù)24小時，利用持續(xù)的負壓作用，使加載組鈦試件孔隙中充滿SA/HA混合懸濁液。去除試件表面多余凝膠，小心將試件置于-20℃冰箱中過夜，然后再置于-80℃冷凍干燥機中凍干24小時，最后形成孔隙中均勻充滿SA/HA微支架的復合支架結構。

3表面分析采用

SEM對三組支架表面形貌進行觀察，同時，通過XPS檢測三組試件表面的元素組成。

4手術

6只比格犬術前12小時禁食，手術前2小時肌肉注射青霉素（40萬u/d），術中行速眠新（0.08ml/kg）和戊巴比妥鈉（0.8ml/kg）復合麻醉。分別對四肢股骨區(qū)域進行備皮，消毒，鋪巾，切開表皮并分離筋膜和肌肉，暴露出支架植入區(qū)域股骨，支架植入區(qū)域位于后肢股骨髁部近心端，生理鹽水冷卻，使用直徑為10mm的空心環(huán)柱形骨鋸和慢速直機配球鉆進行種植窩預備，預備完成后，分別植入三組鈦試件（分別在各組中隨機抽取5枚），分層嚴密縫合。術后，抗生素(頭孢唑啉，20毫克/公斤)在術后3天內進行了注射，傷口每天消毒。在整個術后的康復期里，嚴密觀察比格犬的恢復狀況和術區(qū)感染情況。股骨種植區(qū)暴露如圖1所示。

圖1 植入復合支架

5骨密度測量術后1、3、6月，在麻醉狀態(tài)下，對每支實驗犬進行CBCT掃描，應用自帶的Simplant軟件對三組支架與犬股骨接觸區(qū)域進行骨密度值的測量。每個標本選擇3個矢狀截面，層厚0.5mm，每個截面測量單位面積（1.00mm2）支架兩端和中間3個位點的骨密度值，取平均值進行比較。如圖2所示。

圖2 骨密度測量示意圖

6統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示。對同一時間點數據采用單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗，檢驗水準雙側ɑ=0.05。

結果

1 表面形貌

采用SEM檢查，可以觀察到：NPO組（圖3A，3D）表面呈現出無設計的3D打印的表面鈦合金表面形貌，不規(guī)則粗糙，可見未熔融金屬顆粒；PO（圖3B，3E）組可見均勻規(guī)則的孔隙，孔隙內無加載；LPO（圖3C，3F）組試件表面同樣可見均勻規(guī)則孔隙，孔隙中均勻分布著不規(guī)則互相連通的多孔支架結構，支架周圍與多孔鈦內壁相連，支架孔隙的孔徑范圍從20到200μm不等，支架表面可見白色HA顆粒，均勻分布。

圖3 三組試件在SEM下表面形貌圖

2 表面元素分析

圖4 X射線光電子能譜

XPS檢測分析元素組成如圖所示：三組均含有C，N，O元素，NPO和PO組表面元素和曲線一致；LPO組較其他兩組，N，O元素峰值顯著增高。說明實驗組加載了含N，O元素的HA/SA微支架結構。

3 骨密度測量

術后3月，三組支架材料CBCT測量值在某個矢狀截面的數值如圖5所示，各時間點三組鈦支架表面骨密度測量均值如表1所示，經統(tǒng)計學分析發(fā)現LPO組骨密度均值明顯大于NPO和PO組，三組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖5 骨密度測量

表 1 三組植入支架表面骨密度值（HU，±s）

表 1 三組植入支架表面骨密度值（HU，±s）

與NPO組比較：*P＜0.01；與PO組比較#P＜0.05。

組別 例數HU 1 3 6 NPO 5 730.25±211.45 975.67±168.59 1014.75±138.37 PO 5 980.75±251.85* 1193.89±251.93* 1251.67±231.47*LPO 5 1146.12±209.33*# 1493.78±165.17*# 1620.33±171.82*#

討論

理想的種植體在與周圍組織發(fā)生反應后不能導致機體組織的繼發(fā)性改變，其表面微觀形貌應有利于毛細血管的新生和與骨組織形成良好的機械鎖結作；同時，必須具有一定機械強度及與界面骨組織相近的彈性模量，以便承受咬合力和將力均勻分散。理想的種植體必須具有理想的生物相容性，表面形貌還應具備在植入體內后有利于蛋白的快速吸附，細胞的粘附、增殖、分化，以及具有骨誘導作用以縮短界面骨結合時間，同時應具有良好的抗腐蝕性能[3，4]，可以阻止細菌在表面附著，同時提供生物活性因子。通過對種植體表面的處理改性，在表面形成具有誘導骨組織的形成和達到生物化學結合的生物活性膜或涂層。關于種植體的表面處理，前人嘗試過各種方法，如傳統(tǒng)機械加工的光滑表面，HA和殼聚糖表面涂層，鈦離子噴涂處理，噴砂、酸蝕處理，微弧氧化和激光表面處理等[5-7]。

選擇性激光燒結是3D打印技術中的一種，它通過纖維激光逐層熔化燒結金屬粉末從而得到所想要的物體結構。這種新興技術能夠設計出任意尺寸和內部結構，同時避免了化學污染，實現了個性化定制[8-10]。

HA材料能夠模仿骨的天然胞外基質并促進骨和軟骨細胞的粘附，具有良好的生物相容性和骨傳導性。藻酸鹽及其與HA的復合支架在生物醫(yī)學中表現出極好的應用，由于藻酸鹽支架缺乏足夠機械強度來模擬骨的天然功能，它與無機材料如HA結合以增強強度以及骨組織形成。支架在骨組織工程中的理想作用是通過機械強度，細胞增殖和內壁表面形態(tài)為新的骨組織生長提供最佳條件。Luo Yet等[11]通過3D繪圖技術和原位礦化制造的具有HA層的藻酸鹽/納米HA復合支架，有助于細胞附著和鋪展，支持蛋白質釋放。Yan Jet等[12]設計研究出可注射SA/HA凝膠支架結合明膠微球用于藥物遞送和釋放及成骨實驗研究。Wang Qet等[13]通過3D打印出Atsttrin/nHA支架，通過干預TNF/TNFR促進骨缺損再生，研究發(fā)現該結構精確，抗炎，促進成骨。

真空冷凍干燥技術的原理是先將原始物料冷凍起來，使富含水分的部分凝結形成冰塊，接著在真空條件下，通過升華作用使物料達到干燥目的。該技術降低了物料的氧化變質，滅除物料中的細菌，物料原本的外形能得到很好的保留，并保證了品質[14，15]。本實驗采用選擇性激光燒結技術，通過軟件設計并打印出具有均勻孔隙的多孔鈦支架結構，鈦合金試件表面及孔隙表面具有微粗糙度，對成骨細胞粘附起促進作用。通過冷凍干燥技術，在孔隙中加載SA/HA微支架，獲得更適合成骨細胞長入的微孔隙結構，利用微支架良好的生物相容性和骨傳導性，促進新骨的形成和長入。通過CBCT對支架與骨結合處骨密度值的掃描測量，發(fā)現加載SA/HA微支架的實驗組獲得了更高的骨密度均值，在支架周圍形成更多的新骨。

綜上所述，3D打印多孔鈦表面孔隙中加載SA/HA微支架結構具有良好的生物相容性和骨誘導性，可以促進新骨的形成和長入。為后期3D打印種植體的研究具有促進作用，具有廣闊的應用前景。