常漢臣，王琛，王培霞，周見庭，李炳志

生物工程與大健康

李炳志 天津大學教授、博士生導師，主持國家重點研發(fā)計劃合成生物學重點專項項目、國家基金委優(yōu)秀青年基金項目、天津市杰青基金等。已在、、、、等國際期刊發(fā)表SCI論文70余篇；申請中國發(fā)明專利40余項，授權中國發(fā)明專利20項，國際PCT專利1項。2017年入選教育部長江青年學者獎勵計劃，2015年獲得第二屆“閔恩澤能源化工獎”青年進步獎，2017年獲得世界華人化工大會杰出青年獎，2018年獲得侯德榜化工科技青年獎。擔任SCI期刊客座編輯、編委、生物技術綜合類新期刊的編委。

DNA組裝技術

常漢臣1,2，王琛1,2，王培霞1,2，周見庭1,2，李炳志1,2

1 天津大學 系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室 教育部合成生物學前沿科學中心，天津 300072 2 天津大學化工學院 化學科學與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072

DNA組裝是合成生物學研究的核心技術。隨著合成生物學的發(fā)展，研究者開發(fā)了依賴于DNA聚合酶或DNA連接酶的不同DNA組裝技術；為了降低組裝成本和便于實現(xiàn)DNA組裝的自動化，也發(fā)展了一些非酶依賴的DNA組裝技術；而幾百kb到Mb的大片段DNA的組裝則多數(shù)依賴于微生物體內(nèi)重組。文中主要綜述了酶依賴、非酶依賴和體內(nèi)同源重組三類DNA組裝技術及其發(fā)展情況。

合成生物學，DNA組裝，酶依賴，同源重組，合成

合成生物學旨在應用工程學的研究思路及手段去設計改造基因元件、生物途徑，甚至合成基因組[1]，是一個綜合了科學與工程的新興研究領域，在生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源及環(huán)保等方面具有巨大的應用潛力。DNA組裝方法是整個合成生物學的基礎[2]。合成生物學依賴于將組裝的特定DNA片段導入底盤內(nèi)發(fā)揮功能來實現(xiàn)意圖，因此，高效的DNA組裝是合成生物學的關鍵技術之一。隨著生物科學研究的發(fā)展，對需要調(diào)控的基因功能需求越來越大，DNA長度一般情況下與其功能多少是正相關的，這就對DNA組裝技術提出了越來越高的要求。尤其是近年來快速發(fā)展的基因組設計合成領域，更是需要超大DNA片段的組裝技術的支撐。文中將主要從幾種常用和近期發(fā)展的DNA組裝技術展開闡述。

1 酶依賴的DNA組裝

1.1 基于DNA聚合酶的DNA組裝

19世紀80年代中期，PCR的發(fā)明為依賴于DNA聚合酶的DNA組裝技術的興起與發(fā)展創(chuàng)造了良好的基礎[3-4]。依賴于DNA聚合酶的DNA組裝方法主要是利用DNA聚合酶的外切活性和聚合作用可以高效地將幾個DNA片段組裝在一起，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出幾種比較常用的技術，如聚合酶循環(huán)組裝技術、重疊延伸PCR技術等。

聚合酶循環(huán)組裝 (Polymerase cycling assembly，PCA) 是基于PCR技術，可將10?20條長度為40?70 bp的寡核苷酸片段組裝成長片段。PCA組裝的基本思路是將可化學合成的寡核苷酸通過無模板PCR組裝成短的DNA片段。1989年，Pease等[5]提出重疊延伸PCR技術 (Overlap extension polymerase chain reaction，OE-PCR)，這種方法可以用于組裝更長片段的DNA。OE-PCR示意圖如圖1所示，將末端具有重疊序列的DNA片段通過變性、退火，然后互為引物，經(jīng)聚合酶延伸得到融合的DNA，一般可以將2?6 個DNA片段按比例混合作為模板，以最外側兩端的寡核苷酸作為引物，進行重疊延伸，同時要保證相鄰的兩個DNA片段之間有20?40bp的同源重疊區(qū)。由于OE-PCR方法操作簡單，省時省力，已經(jīng)得到了廣泛的應用[6]。2003年，Smith等[7]將連接酶拼接法 (Ligase chain reaction，LCR) 與重疊延伸 PCR法相結合，合成了噬菌體φX174基因組全長序列 (5386 bp)。

圖1 OE-PCR方法示意圖(將待組裝的兩個DNA片段分別用一對引物通過PCR擴增，使PCR產(chǎn)物之間有同源區(qū)段。接著，用F1和R2引物通過PCR擴增得到完整雙鏈目的片段)

1.2 基于核酸內(nèi)切酶的組裝

1.2.1 BioBrick技術

BioBrick最初是由美國麻省理工學院的Knight研究組于2003年提出，BioBrick方法示意圖如圖2所示。該方法是利用一對同尾酶和兩個非同尾酶來將載體和DNA元件標準化，形成元件庫；標準化的元件可以通過DNA連接酶作用根據(jù)順序依次組裝起來[8]。同尾酶是一類基因工程重要的工具酶，在發(fā)揮作用時識別的位點不相同，但是酶切之后形成的粘性末端是相同的。常用的同尾酶有：Ⅰ/Ⅰ/Ⅰ、HⅠ/Ⅱ、Ⅰ/Ⅰ等。

基于同尾酶酶切的連接組裝方法根據(jù)所使用的同尾酶和非同尾酶的數(shù)量又可以分為BioBrick、BglBrick和ePathBrick。此類方法興起以后產(chǎn)生了一大批合成生物學領域非常有價值的生物組件和途徑，推動了合成生物學的發(fā)展[9-11]。這種方法的優(yōu)勢是可以實現(xiàn)元件的標準化和即插即用。但是兩個DNA元件之間有6 bp的殘痕，元件組裝通量較低[12]。針對這種方法存在的問題，科學家們想出了兩種方案，即BglBrick和ePathBrick，其主旨都是將殘痕轉(zhuǎn)化為融合蛋白的連接肽[13-14]。其中BglBrick采取多基因共表達的策略，要求每個基因都帶有自身的表達元件，最后利用限制性同尾酶將各個元件串聯(lián)起來，獨立進行表達。Anderson等使用一對同尾酶(Ⅱ和HⅠ)、非同尾酶(RⅠ和Ⅰ) 構建標準化組裝載體，巧妙地將這6 bp殘痕設計為兩個氨基酸，既解決了DNA殘痕問題，又實現(xiàn)了融合蛋白構建，可謂一舉兩得[15]。

1.2.2 Golden Gate技術

Golden Gate 組裝是利用ⅡS類限制性核酸內(nèi)切酶識別位點與切割位點不同的特性，靈活設計不同的粘性末端，從而實現(xiàn)同時組裝多個DNA片段，如圖3所示。這一方法通過一步酶切連接，可以高效地構建得到重組質(zhì)粒，從而實現(xiàn)多片段一步法無縫連接[16-18]。Engler等[19]利用上述原理結合基因改組技術(Gene shuffling)，創(chuàng)造性地一次性完成了3個片段與載體的拼接，構建了理論上可達19 683種不同的重組胰蛋白酶原基因，以篩選高效表達的胰蛋白酶突變體。中國科學院深圳先進技術研究院在此技術基礎上，設計了YeastFab和EcoExpress兩個組裝系統(tǒng)，拼接效率可達90%以上，主要用于工程細胞的代謝通路優(yōu)化和蛋白表達[20-21]。

圖2 BioBrick方法示意圖(SpeⅠ和XbaⅠ是一對同尾酶，用SpeⅠ和XbaⅠ分別酶切DNA片段后得到的粘性末端相同，堿基互補之后原酶切位點也消失，片段成功組裝)

圖3 Golden Gate方法示意圖(RFP全稱是Red Fluorescent Protein. 帶有RFP基因的載體在組裝過程有助于初步篩選陽性克隆子. BsaⅠ是ⅡS類限制性核酸內(nèi)切酶.用其分別切割帶有基因1、基因2、RFP的載體，得到帶有粘性末端的片段和載體. 最后，通過連接酶成功將基因1和基因2組裝到原帶有RFP的載體上)

除此之外，近幾年一些新發(fā)展的基于核酸內(nèi)切酶的組裝方法，如MASTER技術[22]、不完全依賴于重疊序列的拼接方法USER[23]、PSA技術[24]，提升了科研人員操作DNA的能力，部分方法已經(jīng)應用到合成生物學的各個方面[25]。

1.3 基于核酸外切酶的組裝

1.3.1 Gibson組裝技術

Gibson組裝是2009年由Gibson開發(fā)，進行DNA多片段體外一步拼接的技術[26]。Gibson組裝方法示意見圖4，在反應體系中加入核酸外切酶、Pusion DNA聚合酶和DNA連接酶，50 ℃下反應60 min即可完成組裝。Gibson組裝可以實現(xiàn)無縫拼接，而且組裝尺度可以達到百kb大小。Gibson等[27]通過調(diào)節(jié)酶比例成功組裝成163 kb的小鼠線粒體基因。

1.3.2 SLIC組裝技術

SLIC組裝方法是利用T4 DNA聚合酶的外切活性，產(chǎn)生不同單鏈DNA末端，然后采用單鏈退火或RecA介導的體外重組，一次反應可以拼接5?10個DNA片段，SLIC組裝方法示意圖如 圖5所示。SLIC一次性的組裝較多片段時，需要片段之間有比較長的重疊區(qū)。SLIC法可進行多片段的平行組裝，是構建生物途徑的重要技術[28]。

圖4 Gibson組裝方法示意圖(利用T5核酸外切酶的5’外切酶活性酶切片段A和片段B，然后Phusion DNA聚合酶催化填補空缺，Taq連接酶修補切口)

2009年，Elledge研究組[29]就是利用該方法成功實現(xiàn)了9個275?980 bp長度的DNA片段的一步拼接。后來，科學家又提出了SLIC組裝方法的改進版SLiCE組裝方法。SLICE與SLIC的不同在于它不需要額外的聚合酶和DNA連接酶，操作簡單，省時省力[30]。

2 非酶依賴的DNA組裝

雖然酶依賴的DNA組裝方法有高效、操作簡單的優(yōu)勢，但也有其缺陷。比如，商業(yè)化限制性內(nèi)切核酸酶的數(shù)量有限，大的基因片段有時很難找到合適的限制性酶切位點等。而非酶依賴的DNA組裝方法在沒有酶的情況下也能實現(xiàn)DNA組裝且成本較低，在高通量組裝實驗條件下，非酶組裝優(yōu)勢明顯。非酶依賴的DNA組裝技術主要有TPA技術和EFC技術等。

2.1 EFC技術

EFC (Enzyme-free cloning) 組裝技術，是一種非酶依賴的DNA組裝方法[31]。該技術不受限于限制性內(nèi)切酶位點，具有快速可靠、簡便高效的優(yōu)點。該方法利用帶尾引物使插入的片段與載體在PCR變性反應之后交錯互補。具體來說就是對載體和片段分別進行兩次PCR。雖然都是PCR，但是所用的引物是有區(qū)別的。一次PCR所用引物是用5?短和3?長(尾) 引物，另一次PCR則使用5?長和3?短引物；長引物與短引物之間的區(qū)別在于長引物多了12?15 bp的尾巴。4次PCR過后兩個非同源的待插入片段分別與兩個載體中的一個互補，從而確保所需片段的定向克隆。將4種PCR產(chǎn)物的等摩爾體積混合，熱變性和重新退火；從得到的產(chǎn)物中選擇所需要的低溫退火，最后得到目的片段。EFC方法示意圖見圖6。

圖5 SLIC組裝方法示意圖(用一對帶有重疊序列的特異性引物擴增目的基因，用限制性內(nèi)切酶或PCR擴增得到線性化質(zhì)粒；接著，T4 DNA聚合酶分別處理PCR擴增得到的目的基因和線性化質(zhì)粒，產(chǎn)生5?突出端的粘性末端；最后，目的基因和線性化質(zhì)粒經(jīng)過重疊序列間的退火，得到帶有“缺口”的環(huán)狀質(zhì)粒)

Fig. 5 Schematic diagram of the SLIC assembly method. The target gene is amplified by a pair of specific primers with overlapping sequences, and the linearized plasmid is amplified by restriction endonuclease or PCR; then, the target gene and linearized plasmid obtained by PCR amplification are respectively treated by T4 DNA polymerase. The sticky end of the 5? overhang is generated; finally, the target gene and the linearized plasmid are annealed between the overlapping sequences to obtain a circular plasmid with a “nick”.

2.2 TPA技術

2017年，趙惠民教授的科研團隊[32]提出一種高效準確的多片段DNA組裝方法(具體組裝流程見圖7)，即Twin-primer non-enzymatic DNA assembly (TPA)。該組裝方法在不使用酶的情況下能夠?qū)⒕酆厦告準椒磻獢U增的片段組裝成質(zhì)粒，并且不留下疤痕。盡管在整個過程中都沒有酶的參與，但是該方法的效果卻可以和最佳的體外組裝方法相當。具體操作分為兩步：在第一步中，設計長上引物和短下引物以及短上引物和長下引物，利用聚合酶鏈式反應分別對片段進行擴增，長引物的設計為片段擴增出片段之間的同源區(qū)段。值得注意的是第一步中產(chǎn)生了不需要的擴增片段，需剔除。第二步中，將第一步中得到的正確的擴增片段通過退火組裝成一個質(zhì)粒，驗證正確后轉(zhuǎn)化到菌內(nèi)。

3 依賴于體內(nèi)同源重組的DNA組裝

盡管體外拼裝的片段大小已經(jīng)可達幾百kb，但是所得的量依然不足以進行后續(xù)實驗[33]。微生物體內(nèi)的同源重組使高效組裝更大的DNA片段成為可能。同源重組是借由重組酶的催化作用，通過兩個具有同源序列DNA分子間的交換，從而使序列發(fā)生重組。這種生物學現(xiàn)象在自然界正常細胞體內(nèi)普遍存在。而基于同源重組的DNA組裝是人工控制同源重組酶的酶切和交換功能，在體內(nèi)把同源片段重組的組裝方法。該方法是非常重要的遺傳操作技術，廣泛應用于DNA元件的組裝、克隆、置換、敲除、突變等。常用的同源重組工具菌株包括釀酒酵母和枯草芽孢桿菌。

3.1 TAR技術

釀酒酵母具有高效同源重組的能力，已經(jīng)發(fā)展了TAR (Transformation-associated recombination) 技術。TAR組裝方法示意見圖8。酵母的同源重組可以組裝寡核苷酸，也能組裝很長的DNA片段，乃至細菌的基因組。

圖6 EFC組裝方法示意圖

圖7 TPA組裝方法示意圖

2008年，Venter研究組[34]利用該方法在釀酒酵母體內(nèi)完成了對生殖道支原體基因組(582 970 bp) 的最后一步組裝。2010年，他們又成功完成了大小為1 080 Mb 的絲狀支原體基因組在釀酒酵母體內(nèi)的同源組裝[35]。Shao等[36]采用類似的“DNA Assembler”法將兩個生物合成途徑共8個基因構建到一個載體上，并成功地檢測到了代謝產(chǎn)物。2017年，由酵母基因組合成計劃SC2.0聯(lián)盟成員完成了釀酒酵母5 條染色體的人工設計與合成，主要是利用了釀酒酵母同源重組能力實現(xiàn)了合成染色體片段對野生染色體片段的替換[37-43]。酵母細胞內(nèi)組裝可廣泛應用于基因元件、代謝途徑和基因組的組裝，為后續(xù)的科學研究提供良好的材料。

3.2 CasHRA技術

CasHRA技術是由中國科學院植物生理生態(tài)研究所覃重軍研究員團隊開發(fā)的。這種方法能夠在體內(nèi)有效組裝多個大DNA片段。主要是利用RNA引導的Cas9核酸酶切割早先引入釀酒酵母中的大的環(huán)狀DNA，從而使環(huán)狀DNA變成線性，最終利用內(nèi)源性同源重組系統(tǒng)進行組裝。該課題組將此方法與上游裝配方法相結合，成功構建了一個包含449個必需基因和267個重要生長基因的1.03 Mb MGE-syn1.0 (Minimal genome of)[44]。該方法將對兆堿基大小的基因組的構建產(chǎn)生深刻的影響。

圖8 TAR技術合成基因示意圖

3.3 枯草芽孢桿菌體內(nèi)的同源重組

枯草芽孢桿菌中也有強大的重組系統(tǒng)。利用枯草體內(nèi)的重組系統(tǒng)同樣可將兩端帶同源序列的片段通過重組的方法連接起來。2005年，Itaya等[45]將3.5 Mb的集胞藻PCC6803的基因組成功克隆到4.2 Mb的枯草芽孢桿菌基因組中，所用方法被稱為“蠕動延伸法”。在此方法的基礎上，Itaya等[46]進一步開發(fā)了一種新的“多米諾法”，利用這種方法成功合成了16.3 kb的小鼠線粒體基因組以及134.5 kb的水稻葉綠體基因組。這種方法所用的底盤細胞是整合了pBR322序列的枯草芽孢桿菌。所用策略是將待合成的基因拆分成帶有同源區(qū)段的5 kb片段，然后分別將其構建到不同的載體上，通過逐步替換，將所有的片段和抗性整合到枯草芽孢桿菌的BGM載體位點。這種組裝方法由于需較長的同源臂以及耗費時間，目前未得到普遍使用。

除酵母和枯草芽孢桿菌可以利用自身的同源重組酶組裝大片段的DNA之外，部分細菌通過超表達T4連接酶或整合λ Red重組系統(tǒng)也能夠介導大片段DNA的胞內(nèi)組裝。將待組裝的DNA片段導入宿主細胞內(nèi)即可進行組裝，通過篩選可得到目的片段。

3.4 Cre/loxP介導的DNA體內(nèi)組裝

Cre/loxP重組酶系統(tǒng)是由Sternberg和Hamilton提出。Cre是一種來源于P1噬菌體的重組酶，Cre 重組酶在沒有輔助因子的情況下催化2個loxP 位點之間的位點特異性重組反應[47]。loxp是一段長度為34 bp的DNA序列，由2個13 bp的反向重復序列和1個8 bp的不對稱間隔區(qū)所分隔的回文結構組成，其是重組酶介導重組反應所必需的條件[48]。Cre重組酶根據(jù)2個loxP位點的排列方向介導4種不同的重組方式：1) 刪除。當同一條DNA分子上的2個loxP位點的排列方向相同時，則可能出現(xiàn)2個loxP位點之間的基因被刪除的情況，最終只剩下一個loxP位點，這種方式是Cre/loxP重組酶系統(tǒng)最主要的作用方式。2) 交叉。如果基因組中的不同DNA分子上各有l(wèi)oxP位點時，可能出現(xiàn)loxP位點前后基因發(fā)生交叉換位。3) 移位。當基因兩端的loxP位點方向相同時，則可能發(fā)生移位，轉(zhuǎn)移到另一個位置上單獨的loxP位點上。4) 顛倒。同一條DNA分子上2個loxP位點方向相反時，則2個loxP位點之間的基因可能會發(fā)生顛倒。Cre/loxP重組酶系統(tǒng)不受制于位置以及片段長度，已經(jīng)廣泛應用于體內(nèi)組裝、體外應用中。體外應用聚焦于高通量DNA克隆和腺病毒載體構建[49-50]，體內(nèi)的應用則主要集中于基因的替換和敲除以及染色體畸變[51-52]，擁有廣闊的應用前景。

4 展望

合成生物學近幾年得到了飛躍式的發(fā)展，不同尺度的DNA 組裝方法相繼誕生，為我們不斷探索更長的片段組裝提供了可能，特別是超大DNA的組裝也越來越成為可能。不同的組裝技術具有不同的適用性，通常的策略都是幾項技術的聯(lián)合使用。學科交叉也一定程度上推動了DNA組裝技術的發(fā)展。但還是存在一些問題需要我們?nèi)ソ鉀Q。一方面是雖然目前我們組裝的片段長度越來越長，但還是有一定的限制，需要開發(fā)更加高效的組裝方法。近些年不斷發(fā)展的DNA酶法合成技術為實現(xiàn)更長DNA片段的直接合成提供了良好的思路，其是一種高效、低耗的DNA合成方案，值得不斷地去研究與拓展。另一方面DNA片段在連接過后可能會有疤痕存在，可能會對后續(xù)實驗有影響，同時，組裝的準確度和可調(diào)性也需要我們不斷去探索更好的方法去解決。這就需要在深入揭示相關機制的基礎上，不斷開 發(fā)新的分子生物學技術，各類組裝技術的特點 見圖9。

圖9 組裝技術的總結

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DNA assembly technologies: a review

Hanchen Chang1,2, Chen Wang1,2, Peixia Wang1,2, Jianting Zhou1,2, and Bingzhi Li1,2

1 Frontier Science Center for Synthetic Biology, Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

DNA assembly is the core technology of synthetic biology. With the development of synthetic biology, researchers have developed different DNA assembly technologies that rely on DNA polymerase or DNA ligase, and also have developed some non-enzyme-dependent DNA assembly techniques to facilitate the automation of DNA assembly. The assembly of large fragments of DNA from a few hundred kb to Mb is mostly dependent on microbial recombination. In this paper, the three types of DNA assembly technologies, including enzyme-dependent, non-enzymatic andhomologous recombination, are reviewed.

synthetic biology, DNA assembly, enzyme-dependent, homologous recombination, synthesis

June 24, 2019;

August 30, 2019

National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0900100).

s:Bingzhi Li. Tel: +86-22-27402503; E-mail: bzli@tju.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃 (No. 2018YFA0900100)資助。

2019-10-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191010.0937.002.html

常漢臣, 王琛, 王培霞, 等. DNA組裝技術. 生物工程學報, 2019, 35(12): 2215–2226.

Chang HC, Wang C, Wang PX, et al. DNA assembly technologies: a review. Chin J Biotech, 2019, 35(12): 2215–2226.

(本文責編 陳宏宇)