許曉輝，楊志敏，朱天虹,張虹艷，李晨曦，杜銳滸

(蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730050 )

青黛為爵床科植物馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)或十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort)的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末或團(tuán)塊. 青黛具有涼血、清熱解毒的功效，常用于溫毒發(fā)斑、胸痛咳血、小兒驚癇等，是一種廉價(jià)易得的中藥材[1]. 《中國藥典》一部收載了青黛的質(zhì)量控制檢驗(yàn)方法. 近年來，監(jiān)督抽檢發(fā)現(xiàn)，市售青黛質(zhì)量差異較大，存在摻偽染色現(xiàn)象[2-3]. 而非法摻入的染色物質(zhì)有毒、致癌，食用染色的青黛不僅無預(yù)期療效，反而會加重病情，對人體帶來嚴(yán)重的危害. 為了對青黛的質(zhì)量進(jìn)行控制，有必要對青黛染色物質(zhì)進(jìn)行全面監(jiān)測. 常用于青黛的染色物質(zhì)主要有孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍(lán)等，其中，隱色孔雀石綠是孔雀石綠的代謝產(chǎn)物，在非法摻入時(shí)，都是以成品形態(tài)的化學(xué)化合物添加. 目前已報(bào)道的孔雀石綠的檢測方法主要有高效液相色譜法和拉曼光譜法[4-5]，其他與孔雀石綠相似的染色物質(zhì)未見文獻(xiàn)報(bào)道. 液相色譜難以分離復(fù)雜基質(zhì)樣品，導(dǎo)致準(zhǔn)確地定性定量存在一定困難，而拉曼光譜的基底不容易制備. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)作為一種適合于微量復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測技術(shù)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)勢. 本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS )，建立了以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)定性定量測定青黛中非法摻入染色物質(zhì)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍(lán)的方法，該方法前處理簡單，一針進(jìn)樣，在13 min內(nèi)可同時(shí)測定6種染色物質(zhì)，能夠?qū)η圜旆欠〒饺肴旧镔|(zhì)的監(jiān)測提供技術(shù)支撐.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀6460：配有電噴霧離子源(美國安捷倫有限公司)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g(梅特勒-托利多有限公司)；真空泵(天津市津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；移液槍：20、100 μL和1.00 mL(德國艾本德)；渦旋混合器(美國Scientific)；離心機(jī)(德國艾本德)；超聲波清洗器(美國Corning)； 容量瓶(天玻儀器)；超純水(密理博，純水凈化系統(tǒng))；乙腈(色譜純，德國Merk)，甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)，青黛樣品：購自市場上的青黛粉末.

標(biāo)準(zhǔn)品： 孔雀石綠草酸鹽(Lot：107047，純度：95.8%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)；隱色孔雀石綠(Lot：G139783，純度：99.6%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)；孔雀石綠草酸鹽-D5(Lot：OP022，純度：99.6%，WiTEGA)；隱色孔雀石綠-D6(Lot：OP015，純度：100%，WiTEGA)；亞甲基藍(lán)(Lot：1-DRJ-57-1，純度：96%，Toronto Research Chemicals)；天青A(Lot：B420BA0016，純度：80%，BBI Life Sciences)；天青B(Lot：B326BA1467，純度：75%，BBI Life Sciences)；天青C(Lot：EC19BA0005，純度：50%，BBI Life Sciences) .

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0×100 mm，2.7 μm)；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：3 μL; 流動相A為含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫程序如表1所列.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI，正離子模式(+)；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣：N2；干燥氣流速：8 L/min；噴嘴電壓：500 V；氣流溫度：325 ℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；定性離子對、定量離子、碎裂電壓、碰撞能量和離子化模式如表2所列.

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液制備

6種染色物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別精密稱取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍(lán)對照品10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成單個(gè)質(zhì)量濃度均為 1 mg/mL的儲備液，置 4 ℃冷藏備用. 使用時(shí)用乙腈-水(體積比20∶80)稀釋配制成不同濃度的混合中間液和混合標(biāo)準(zhǔn)使用液.

表2 6種染色物質(zhì)的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Major mass spectral parameters of 6 dyes

孔雀石綠草酸鹽-D5、隱色孔雀石綠-D6內(nèi)標(biāo)儲備溶液：分別精密稱取孔雀石綠-D5、隱色孔雀石綠-D6對照品10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，配制成單個(gè)質(zhì)量濃度均為 1 mg/mL的儲備液，置 4 ℃冷藏備用. 使用時(shí)用乙腈-水(體積比20∶80)稀釋配制成不同濃度的混合中間液和混合標(biāo)準(zhǔn)使用液.

1.4.2 供試品溶液制備

精密稱取樣品0.2 g(精確至0.000 1 g)，置于50 mL離心管中，精密加入含5%甲酸的乙腈溶液10 mL，渦旋1 min，超聲提取30 min，放冷至室溫，5 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾(0.22 μm，有機(jī)相)，取續(xù)濾液作為待測液.

1.4.3 陰性樣品溶液的制備

按照“1.4.2供試品溶液制備”步驟，取未檢出6 種染色物質(zhì)的青黛粉末樣品同法制成陰性樣品溶液，即空白基質(zhì)樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

由于這6種染色物質(zhì)在乙腈和水中都具有較好的溶解度，另一方面，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),酸度對染色物質(zhì)的提取有影響. 因此，考察了含1%、3%、5%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑對回收率的影響，結(jié)果表明，酸度在1%～5%之間時(shí)，提取回收率變化差異不是很大. 考慮到這6種染色物質(zhì)在酸性溶液中更易溶解，為定量測定提供保障，最終選擇含5%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑. 在超聲提取時(shí)間上，考察了10、20、30 min的提取回收率，隨著時(shí)間的延長，提取回收率有所提高，但是無顯著差異，最終選擇超聲提取30 min.

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

液相色譜分離條件的優(yōu)化：液相色譜檢測極性化合物時(shí)，分離常用的色譜柱有C18和C8 兩種. 本方法采用適合極性化合物分離的Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱，選擇流速為0.5 mL/min，使柱壓達(dá)到適宜的數(shù)值，有利于化合物的分離和峰型良好. 流動相的選擇和優(yōu)化：因?yàn)楣┰嚻啡芤旱闹苽涫褂靡译?，因此設(shè)計(jì)了乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液等4種方案. 通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含0.1%甲酸的乙腈-含2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液優(yōu)于其它方案，故本方法采用此流動相. 該流動相的優(yōu)勢是加入甲酸提供正離子化環(huán)境，加入乙酸銨改善被檢測化合物峰型. 質(zhì)譜條件的優(yōu)化：用二通閥聯(lián)接液相色譜與質(zhì)譜，將6種染色物質(zhì)儲備液稀釋至50 ng/mL，分別注入離子源中，在正離子監(jiān)測模式下對每種染色物質(zhì)進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，得到每種染色物質(zhì)的分子離子峰(Q1掃描). 對每種染色物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息. 選擇測定染色物質(zhì)的定性和定量離子對，然后對所選離子的碎裂電壓、碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，使檢測靈敏度達(dá)到最佳. 然后，把質(zhì)譜與液相色譜連接，確定6種染色物質(zhì)出峰順序，進(jìn)行電噴霧電壓、霧化氣、離子源溫度、輔助氣流速等優(yōu)化，使每種染色物質(zhì)的分子離子與碎片離子的離子強(qiáng)度達(dá)到最佳，據(jù)此最終確定為本方法的質(zhì)譜條件.

2.3 6種染色物質(zhì)的總離子流圖

在 MRM 模式下，測定 6種染色物質(zhì)的定性和定量離子對色譜圖，共 12 個(gè)離子監(jiān)測通道. 其總離子流圖如圖 1所示. 由圖1可見，各個(gè)化合物峰形對稱，每個(gè)檢測通道互補(bǔ)無干擾，定量準(zhǔn)確可靠，其MRM圖如圖2所示.

圖1 6種染色物質(zhì)的總離子流圖Fig. 1 Total ion flow of 6 dyes

圖2 6種染色物質(zhì)的MRMFig. 2 MRM of 6 dyes(a) 孔雀石綠，(b) 隱色孔雀石綠，(c) 天青A，(d) 天青B, (e) 天青C, (f) 亞甲基藍(lán), (g) 孔雀石綠-D5,(h)隱色孔雀石綠-D6

續(xù)圖2

2.4 專屬性考察

取陰性樣品溶液 3 μL，按“1.2色譜條件”和“1.3質(zhì)譜條件”進(jìn)樣采集數(shù)據(jù)，得到6種染色物質(zhì)陰性樣品溶液的MRM色譜圖，均未見有其他色譜峰干擾6種染色物質(zhì)的目標(biāo)物成分. 結(jié)果表明，上述青黛樣品基質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測定，方法專屬性良好.

2.5 線性關(guān)系、檢出限、定量限及回收率

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，利用空白基質(zhì)樣品溶液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2、4、6 、8、10、20、30 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，外標(biāo)法定量，X軸為濃度，Y軸為峰面積響應(yīng)值，得到各個(gè)染色物質(zhì)的線性回歸方程(如表3所列)，用于計(jì)算實(shí)際樣品中待測物的濃度. 結(jié)果顯示，6 種染色物質(zhì)在 1～30 ng/mL之間線性關(guān)系良好，R2在 0.998 8～0.999 6之間. 取陰性樣品，混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液通過最小添加量，按“1.4.2供試品溶液制備”同法處理后上機(jī)進(jìn)樣，以信噪比為3計(jì)算各個(gè)染色物質(zhì)的檢出限(LOD)，以信噪比為10計(jì)算各染色物質(zhì)的定量限(LOQ). 6種染色物質(zhì)的檢出限在0.5～1.0 ng/g之間，定量限在1.0～2.0 ng/g之間，結(jié)果如表3所列.

表3 6種染色物質(zhì)線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率Table 3 Linear relationships, detection limits, quantitation limits and recovery rates of 6 dyes

2.6 回收率考察

向陰性樣品中添加低、中、高三個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按“1.4.2供試品溶液制備”進(jìn)行處理，上機(jī)測試，每個(gè)添加水平平行制備3份樣，每個(gè)樣平行測定6次，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，3個(gè)水平的回收率在79.7%～119.7%之間，結(jié)果如表3所列.

2.7 精密度考察

取質(zhì)量濃度均為 8 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液3 μL，按“1.2色譜條件”和“1.3質(zhì)譜條件”進(jìn)樣測定，連續(xù)測定 6 次，分別計(jì)算孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍(lán)的精密度，其 RSD%分別為1.8%、1.8%、1.7%、0.7%、1.8%、1.4%，RSD%范圍在0.7%～1.8%之間，表明方法的精密度良好.

2.8 樣品測定

應(yīng)用本方法對市場采購的8批青黛樣品進(jìn)行測定，未檢出染色物質(zhì)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍(lán)，青黛樣品的總離子流圖如圖3所示.

圖3 青黛樣品的總離子流圖Fig. 3 Total ion flow of indigo naturalis sample

3 結(jié)論

本文以青黛中非法摻入染色物質(zhì)為研究對象， 通過優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件和色譜質(zhì)譜條件，建立了青黛中非法摻入染色物質(zhì)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法. 對建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，其檢測限、定量限、準(zhǔn)確性和精密度良好，并使用本方法進(jìn)行了實(shí)際樣品測定. 結(jié)果表明，本方法前處理簡單高效快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可以用于對青黛中非法摻入染色物質(zhì)進(jìn)行快速篩查，為青黛質(zhì)量控制提供了保障.