姜麗艷，閆國棟，王德利

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012)

為了合理配置大型儀器的優(yōu)質(zhì)資源，提高學(xué)科發(fā)展水平，吉林大學(xué)生命科學(xué)公共技術(shù)平臺購置了多模式小動物活體成像系統(tǒng). 型號為FX PRO，廠家為美國柯達(dá)公司(以下簡稱FX PRO活體成像系統(tǒng)). 該系統(tǒng)可實現(xiàn)多波長熒光成像、生物學(xué)發(fā)光成像、X光成像和同位素成像，為癌癥的發(fā)生及發(fā)展、基因治療、免疫學(xué)、siRNA、干細(xì)胞和蛋白質(zhì)相互作用及分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域提供了直觀的活體偵測手段[1]. 同時，F(xiàn)X PRO活體成像系統(tǒng)也可監(jiān)測體內(nèi)腫瘤的原位變化、藥物分布和蓄積、血管和臟器的動態(tài)變化、免疫熒光標(biāo)記物示蹤和分子相互作用及共定位等[2]. 此外，F(xiàn)X PRO活體成像系統(tǒng)還具有監(jiān)測毫秒級別的鈣離子濃度的瞬間變化、化合物和底物在體內(nèi)的分布和擴散、免疫反應(yīng)以及動物麻醉和清醒狀態(tài)下的藥代動力學(xué)研究等[3-4].

雖然該臺儀器在國內(nèi)外生物制藥業(yè)、科研機構(gòu)和高等院校已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但由于其操作繁瑣，而且學(xué)生對活體成像的相關(guān)知識和實驗技術(shù)還很陌生，所以本科教學(xué)實驗中還未涉及活體成像系統(tǒng)，如此直接影響了學(xué)生整體科研素質(zhì)的提高[5]. 本文旨在結(jié)合該臺儀器的特點和學(xué)生的具體實驗需求情況，系統(tǒng)的介紹FX PRO活體成像系統(tǒng)的使用操作和注意事項，使學(xué)生能夠熟悉活體成像的相關(guān)實驗流程和操作，并通過多種渠道拓寬活體成像的實驗資源，開拓學(xué)生視野，增強活體成像知識，豐富研究性實驗類型.

1 實驗動物模型的制作

動物體內(nèi)很多物質(zhì)如皮毛和血液在受到激發(fā)光激發(fā)后，會發(fā)出自發(fā)熒光，影響檢測的靈敏度. 所以，活體成像實驗時，要盡量使用實驗裸鼠制作動物模型. 而且，動物的尿液或其他雜質(zhì)也應(yīng)盡量及時清除，否則成像中也會出現(xiàn)非特異性信號，影響檢測結(jié)果的靈敏度. 相關(guān)動物模型的建立可以通過尾靜脈注射、皮下移植或原位移植等方法在實驗裸鼠體內(nèi)接種已標(biāo)記的細(xì)胞或組織. 但在建模時應(yīng)認(rèn)真考慮實驗?zāi)康?，并選擇正確的熒光標(biāo)記，尤其是做多個熒光標(biāo)記時，一定要盡量防止熒光串色現(xiàn)象的發(fā)生. 而且要注意當(dāng)標(biāo)記熒光波長短時，則穿透效率不高. 如果建模時不宜接種深部臟器和觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移，可以觀察皮下瘤和解剖后臟器直接成像. 深部臟器和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的觀察大多選用熒光素酶標(biāo)記.

2 FX PRO活體成像系統(tǒng)的圖像拍攝和處理

開啟MI測試軟件后，等待大約15 s，系統(tǒng)電荷耦合器件(CCD)的實時溫度降至-29 ℃，儀器才能正常使用. 系統(tǒng)工作界面分為菜單欄、Capture按鈕、拍攝界面、導(dǎo)航面板、快捷鍵、主窗口和儀器狀態(tài)顯示欄7個區(qū). 點擊“Capture”按鈕，彈出拍攝界面. 先進行光場校正后再完成圖像拍攝[6].

2.1 光場校正

活體成像系統(tǒng)可完成X-Ray、生物發(fā)光、熒光和白光的單模式拍攝，除生物發(fā)光不需要光源，無需進行光場校正之外，其他3種單模式拍攝方式都需要進行光場校正. X-Ray光場校正時使用的是X光磷屏，確保X光磷屏與滑軌正確連接. 熒光校正時使用EPI屏，放置于動物箱的左側(cè)位置，選擇軟件界面的“Preview”進行預(yù)覽，確保動物箱的滑軌已滑至右側(cè). 光場校正時在軟件界面的Illumination source選取Illuination reference，在系統(tǒng)默認(rèn)的參數(shù)基礎(chǔ)上，進行光場較正，點擊“expose”，光場較正后，會出現(xiàn)光場較正文件，選擇“No”. 所有參數(shù)設(shè)定完成后，點擊“new”，設(shè)定文件名，保存完成所有參數(shù)的設(shè)定. 白光的光場校正方法與熒光相同. 拍攝時再將illumination Reference重新選為“Auto select”再進行單圖像拍攝.

2.2 圖像的拍攝

圖像的拍攝分為單模式拍攝、多模式拍攝和特定模式的拍攝. 單模式拍攝是所有拍攝的基礎(chǔ)，也是本科生實驗常用的拍攝方法，每個模式的圖像拍攝都要進行正確的參數(shù)設(shè)定，才能獲得高質(zhì)量的實驗圖像. 因涉及的設(shè)定參數(shù)較多，結(jié)合多年活體成像系統(tǒng)的使用經(jīng)驗，對單模式拍攝的常規(guī)拍攝參數(shù)進行了總結(jié)，僅供參考，要根據(jù)具體的實驗進行實際調(diào)節(jié)(如表1所列). 多模式拍攝是在單模式拍攝參數(shù)設(shè)定完成后進行的拍攝，確保單模式的視野設(shè)定一致，而且一般X光拍攝放到最后. 特定模式的拍攝包括常用于熒光拍攝的延時曝光拍攝，常用于生物發(fā)光的累進曝光拍攝和常用于X光的局部高清拍攝.

2.3 圖像的處理

圖像的處理包括圖像編輯，圖像疊加和圖像輸出. 活體成像系統(tǒng)采集的是光的強弱，而不是光的顏色，所以需要對圖像可以進行偽彩添加編輯. 偽彩是將灰階顯示的圖像轉(zhuǎn)變?yōu)椴噬@示. 常用的偽彩顯示顏色為RGB-Spectrum、fire、grayscale等，根據(jù)實驗的對象，用戶可自行選擇偽彩. 也可以用“invert”進行背景顏色的反轉(zhuǎn). 常用的圖像疊加一般為熒光成像或生物發(fā)光成像和X-光成像進行疊加，疊加的要求是兩張圖像拍攝的是同一張圖像，并已分別完成編輯，且達(dá)到最佳顯示效果，而且必須視野設(shè)定相同；選中X-光圖像的上方，然后在“image display”下拉菜單中，選擇“overlay”，點擊“transparency”，疊加完成. 拍攝完成的圖像，選擇“annotation”填加注釋，選擇“add annotation bar”填加標(biāo)尺，選擇 “file-export data-image”進行圖像的輸出，如輸出的圖像帶有標(biāo)尺格式，必須選擇*.emf的格式.

表1 單模式拍攝的常規(guī)參數(shù)設(shè)定Table 1 General parameter settings of single mode shooting

注：Binning為像素合并，可以有效的提高像素的靈敏度，分為X-Binning和Y-Binning，設(shè)定時先設(shè)定Y-Binning，再設(shè)定X-Binning. FOV 視野，一般2～3只老鼠視野為120或150. Excitation：激發(fā)濾光片 可進行單個或多個選擇. Emission：發(fā)射濾光片，如未找到所需要的濾光片時，用戶可進行自行安裝. 激發(fā)光和發(fā)射光濾光片的放置可以根據(jù)需要進行更換，但“0”位置必須空著，不能放置濾光片. 而且，濾光片長時間不用時必須拿下來進行妥善保存. 其余參數(shù)的設(shè)定僅供參考，需要根據(jù)具體實驗進行調(diào)節(jié).

3 FX PRO活體成像系統(tǒng)在本科生創(chuàng)新實踐中的開發(fā)

3.1 深化基礎(chǔ)本科教學(xué)實驗內(nèi)容

國內(nèi)高校開設(shè)的生理學(xué)基礎(chǔ)實驗中，一般都是經(jīng)典的成型實驗，對理論課的教學(xué)起到了很好的輔助作用. 但經(jīng)典實驗方法簡單，不容易調(diào)動學(xué)生的實驗積極性，不能有效的鍛煉學(xué)生的思考和邏輯思維能力[7-8]. 為了有效的調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，實現(xiàn)生理學(xué)實驗的開設(shè)意義，創(chuàng)新性的將活體成像系統(tǒng)引入本科生的生理實驗教學(xué)，通過嘗試開展觀察小鼠的骨骼形態(tài)，實時監(jiān)測小鼠體內(nèi)腫瘤的原位變化和藥物在體內(nèi)的代謝過程等功能性實驗，逐漸延深生理基礎(chǔ)實驗內(nèi)容，進而提升基礎(chǔ)生理實驗的質(zhì)量[9]. 在接觸和使用活體成像的過程中，學(xué)生能夠更加了解活體成像技術(shù)及其在科學(xué)研究中的應(yīng)用(如圖1、2所示).

圖1 X-ray拍攝Fig. 1 X-ray shooting

圖2 熒光成像和X-ray圖像疊加Fig. 2 Fluorescence imaging and X-ray image superposition

3.2 開發(fā)研究性創(chuàng)新實驗項目

充分利用活體成像系統(tǒng)，為本科學(xué)生開設(shè)大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目，開放創(chuàng)新項目和本科生畢業(yè)設(shè)計實驗等創(chuàng)新研究性實驗項目. 實驗內(nèi)容的設(shè)置要兼顧基礎(chǔ)性和延展性，力求將基礎(chǔ)實踐教學(xué)與科學(xué)研究進行完美結(jié)合[10-11]. 如開設(shè)了疾病生物標(biāo)志物研究項目，培養(yǎng)學(xué)生掌握活體成像系統(tǒng)的使用. 進而設(shè)置了酶與細(xì)胞增殖調(diào)控及腫瘤生物治療研究性項目，使學(xué)生掌握小鼠模型建立等技術(shù)[12-13]. 在實驗的過程中學(xué)生可以參與小鼠飼養(yǎng)、麻醉和模型建立，掌握活體成像系統(tǒng)的樣品準(zhǔn)備，熟悉活體成像系統(tǒng)的基礎(chǔ)操作和圖像處理等實驗的全過程. 基于活體成像系統(tǒng)開設(shè)的研究型創(chuàng)新實驗項目進一步增強了學(xué)生對生理學(xué)實驗的深刻理解，推動研究型學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性教學(xué)方式的改革，同時，也能夠促進大型儀器設(shè)備的資源共享，加強本科教學(xué)的開放和服務(wù)，提高大型儀器設(shè)備利用率[14-16].

4 結(jié)論

多模式小動物活體成像系統(tǒng)可以對活體狀態(tài)下的生物進行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究，具有特異性，強大的標(biāo)記技術(shù)和非侵害性等優(yōu)點[6]. 通過對活體成像系統(tǒng)使用方法的介紹和使用資源的拓展，為活體成像系統(tǒng)的規(guī)范使用和高效運轉(zhuǎn)提供了強有力的支持和保障，為培養(yǎng)大學(xué)生的創(chuàng)新性實驗思維奠定了堅實的基礎(chǔ).