李珍1，陳義三1，陳榮珠1，楊彩媚1，陳楠濱2，盧聞東

(1.福建省漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.福建省漳浦縣舊鎮(zhèn)鎮(zhèn)人民政府，福建 漳州 363213；3.福建省熱帶作物科學(xué)研究所，福建 漳州 363001)

目前，有關(guān)連作障礙形成原因的研究已取得很大進(jìn)展，歸納起來主要有植物化感自毒作用[1]、土壤理化性質(zhì)惡化[2-3]、土壤微生物區(qū)系變化[4-5]等原因，這三大因素均與土壤存在密切關(guān)系。探討連作障礙的成因和尋求消減連作障礙的措施，從植物—土壤—微生物組成的根際微生態(tài)系統(tǒng)出發(fā)，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。植物體內(nèi)的次生代謝物通過淋溶、凋落、根系分泌對微生物群落具有選擇性塑造，使根際微生態(tài)系統(tǒng)失衡，對植物產(chǎn)生負(fù)反饋[6]。微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)、能量流動、養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的主要驅(qū)動力，有研究表明土壤微生物參與了90%左右的土壤反應(yīng)過程[7-8]。因此，分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能的多樣性和動態(tài)性信息，對了解植物連作障礙的形成原因具有重要意義。

生物炭因具有疏松多孔、取材方便、價格低廉、生態(tài)環(huán)保等特點(diǎn)，在緩解連作障礙方面具有很大的優(yōu)勢。研究表明[9-10]，連作土壤中添加一定量的生物炭，微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能得到調(diào)節(jié)，進(jìn)而改善土壤的理化特性，有利于農(nóng)作物的生長，對連作土壤產(chǎn)生的連作障礙有較明顯的緩解作用。

然而，有關(guān)連作穿心蓮根際土壤微生物的研究還未見報(bào)道。因此，本文采用田間對比試驗(yàn)，運(yùn)用平板計(jì)數(shù)法、BIOLOG ECO微平板法和末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)，研究了有無添加生物炭對連作穿心蓮根際土壤微生物的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能多樣性的影響，探討生物炭能否有效緩解穿心蓮的連作自毒障礙，為穿心蓮緩解連作障礙提供理論依據(jù)，為中藥材綠色種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)及取樣方法

試驗(yàn)地設(shè)在漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥用植物園內(nèi)，共設(shè)6個處理：種植1 a(正茬不加炭，記作1 a)、種植1 a[正茬加炭(250 kg/mu，下同)，記作1 a+C]、種植2 a(連作1 a，不加炭，記作2 a)、種植2 a(連作1 a，加炭，記作2 a+C)、種植3 a(連作2 a，不加炭，記作3 a)、種植3 a(連作2 a，加炭，記作3 a+C)。試驗(yàn)地塊相鄰，且均勻、平坦、整齊，具有當(dāng)?shù)卮硇?，每處?次重復(fù)。穿心蓮每年4月清明節(jié)前后播種，苗高10 cm左右移栽，行株距15×18 cm，水肥、中耕除草、病蟲害防治等田間管理措施每年都一致，剛要現(xiàn)蕾時采收。

隨機(jī)挖起3株穿心蓮，采用抖根加毛刷的方法收集根際土壤，去除動植物殘?bào)w等雜質(zhì)，過2 mm篩。用四分法將土壤混勻，一部分置于4 ℃冰箱，用于土壤微生物的培養(yǎng)和多樣性測定；另一部分-80 ℃保存，用于細(xì)菌測序。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 土壤微生物數(shù)量的測定 微生物數(shù)量用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)每克干土內(nèi)所含微生物的個數(shù)[11]。 細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能的測定 采用BIOLOG ECO微平板法[12]，稱取10 g鮮土加入100 ml滅菌的生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.85%)中，120 r/ min-1振蕩30 min，靜置，取懸濁液，稀釋至原濃度的1/1000，吸取150 ml樣品接種于ECO的96孔板中。28 ℃培養(yǎng)，590 nm連續(xù)讀數(shù)7 d。

1.2.3 土壤微生物細(xì)菌的測定 土壤微生物總DNA用土壤DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測。通用引物8F-FAM:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、926R:5'-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3' 擴(kuò)增土壤細(xì)菌16SrDNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、切膠純化，純化后的PCR產(chǎn)物用HaeⅢ和Msp酶切，酶切產(chǎn)物送測序。登錄http://mica.ibest.uidaho.edu/，選擇T-RFLP Analysis(APLAUS+)，輸入相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 平均顏色變化率(AWCD)用于表示土壤微生物代謝活性。

AWCD=∑ (Ci-Ri) /31 式中，Ci為每個有培養(yǎng)基孔的吸光值，Ri為對照孔的吸光值。

Shannon、Simpson和McIntosh三個指數(shù)用來衡量土壤微生物群落功能多樣性。

Shannon指數(shù)(H) H = —∑Pi(InPi)

(1)

Simpson指數(shù)(D) D = 1—∑Pi 2

(2)

(3)

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與所有孔相對吸光值總和的比值(Ci-Ri) / ∑ (Ci-Ri)，ni為第i孔的相對吸光值(Ci-Ri)。

用Excel 2007進(jìn)行平均吸光值(AWCD)、多樣性指數(shù)、顯著性差異分析等工作，用Graphpad prism 7.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對連作穿心蓮根際土壤微生物數(shù)量的影響

在穿心蓮生長發(fā)育過程中，有無添加生物炭對連作穿心蓮根際土壤微生物數(shù)量的影響見圖1-圖3。從圖1可見，未添加生物炭時的細(xì)菌數(shù)量在0、30、60、90、120 d時，正茬分別是連作1 a的1.12、1.16、1.09、1.15、1.32倍，連作1 a分別是連作2 a的1.10、1.08、1.07、1.03、1.06倍，說明連作對穿心蓮根際土壤的細(xì)菌數(shù)量有影響。添加生物炭后的細(xì)菌數(shù)量，在30、60、90、120 d時，連作1 a加炭分別是連作1 a不加炭的1.12、1.07、1.09、1.16倍，連作2 a加炭分別是連作2 a不加炭的1.19、1.09、1.09、1.18倍，說明添加生物炭能有效提升穿心蓮根際土壤細(xì)菌數(shù)量。從圖2可見，放線菌數(shù)量同細(xì)菌數(shù)量變化類似，同樣為隨著種植天數(shù)的增加先升高后下降。大小順序?yàn)椋赫?連作1 a加炭>連作2 a加炭>連作1 a不加炭>連作2 a不加炭。在未添加生物炭時的放線菌數(shù)量，正茬與連作1 a差異顯著；連作1 a與連作2 a除了第90 d外，其它時間點(diǎn)都達(dá)到了差異顯著。添加生物炭后，連作1 a加炭與連作1 a不加炭在第60、90 d時無差異，在第30、120 d時，差異顯著；連作2 a加炭與連作2 a不加炭均差異顯著。從圖3可見，真菌的數(shù)量隨著種植天數(shù)的增加呈現(xiàn)不斷上升的變化趨勢。未添加生物炭時的真菌數(shù)量，在0、30、60、90、120 d時，連作1 a分別是正茬的1.05、1.11、1.09、1.11、1.23倍，連作2 a分別是連作1 a的1.09、1.03、1.00、1.04、1.01倍。但是，添加生物炭后的真菌數(shù)量，在30、60、90、120 d時，連作1 a加炭分別減少到連作1 a不加炭的88%、90%、93%、89%，連作2 a加炭分別減少到連作2 a不加炭的90%、89%、88%、91%。說明隨著穿心蓮連作年限的增加，土壤中的真菌數(shù)量不斷變多；添加生物炭后，土壤中的真菌數(shù)量有所減少。

圖1 生物炭對連作穿心蓮?fù)寥兰?xì)菌數(shù)量的影響

圖2 生物炭對連作穿心蓮?fù)寥婪啪€菌數(shù)量的影響

圖3 生物炭對連作穿心蓮?fù)寥勒婢鷶?shù)量的影響

2.2 生物炭對連作穿心蓮根際土壤微生物多樣性的影響

平均顏色變化率(AWCD)是反映土壤微生物群落活性的重要指標(biāo)。從表1可知，72 h的AWCD值，正茬的收獲期最高；隨著種植年限的延長，到第3年收獲期，AWCD值呈下降趨勢，且差異顯著。說明此模式下根際土壤微生物的碳源代謝能力比正茬要差。多樣性指標(biāo)中，Shannon指數(shù)反映物種的豐富度，McIntosh指數(shù)反映物種的均勻度，Simpson指數(shù)反映物種的優(yōu)勢度。三者數(shù)值越大，表示土壤中微生物群落的功能多樣性越高。表中，Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)隨著連作年限的延長呈下降趨勢，且達(dá)到顯著性差異；添加生物炭后，顯著性差異消失。Simpson指數(shù)則不同，自始至終都無顯著性差異。表明群落多樣性雖有下降，但是卻沒有出現(xiàn)明顯的優(yōu)勢種群。

表1 兩種措施下穿心蓮根際土壤微生物多樣性指數(shù)和72 h AWCD

同一列中不同字母表示差異達(dá)到顯著水平P<0.05，下同。

2.3 土壤微生物對不同類型碳源利用的差異

土壤微生物對不同碳源的利用狀況可以反映微生物群落的代謝功能。從表2可見，隨著種植年限的增加，6類碳源中，土壤微生物群落對碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺類的利用能力逐漸下降，對羧酸、酚酸類的利用能力逐漸上升。在未添加生物炭時，碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺類四大類，連作2 a比正茬分別下降了17.6%、25.6%、10.2%、26.5%；羧酸、酚酸類兩大類分別上升了29.5%、43.1%。添加生物炭后，碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺類四大類，連作2 a加炭比連作2 a不加炭，分別上升了10.7%、19.7%、5.1%、19.7%；羧酸、酚酸類兩大類分別下降了13.9%、13.7%。說明隨著連作年限的不同，土壤微生物對碳源的利用能力不同，連作提高了以羧酸、酚酸類化合物為代謝基質(zhì)的微生物類群的活性，抑制了以碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺類化合物為碳源基質(zhì)的微生物群落的生長代謝。但是添加生物炭后，原先碳源利用能力下降的得到了不同程度的上升回調(diào)，原先碳源利用能力上升的得到了不同程度的下降回調(diào)。

表2 兩種措施下穿心蓮根際土壤微生物碳源利用的差異

2.4 生物炭對連作穿心蓮根際土壤細(xì)菌菌群的影響

由表3可知，該10個門的菌占總菌量的88.45% 以上。其中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門所占比例均大于10%，其余門類所占比例均低于10%。變形菌門、放線菌門在有無添加生物炭時，變化不大。酸桿菌門變化較大，未添加生物炭時，連作1 a、連作2 a分別比正茬上升了16.94%、46.30%；添加生物炭后，連作1 a加炭比不加炭下降了15.31%，連作2 a加炭比不加炭下降了22.30%。值得注意的是，種植第3 a時，出現(xiàn)了硝化螺旋菌門。

表3 兩種措施下穿心蓮根際土壤細(xì)菌前10大門水平的群落結(jié)構(gòu)

3 討論

隨著穿心蓮連作年限的增加，在未添加生物炭的情況下，土壤中可培養(yǎng)微生物總量、細(xì)菌、放線菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增多。這點(diǎn)從AWCD值得變化趨勢可得到證實(shí)，無論是苗期，還是收獲期，都呈下降趨勢，且差異顯著。多樣性指數(shù)也可以從不同方面反映微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性變化。Shannon、McIntosh指數(shù)結(jié)果與可培養(yǎng)微生物數(shù)量、AWCD值一致，均隨著連作年限增加顯著下降，表明微生物數(shù)量和功能隨連作年限增加而下降；但是Simpson指數(shù)在各連作年限間無差異，表明該過程中，微生物優(yōu)勢種群并未發(fā)生變化。根據(jù)微生物對不同類型碳源利用的差異可知，隨著連作年限的增加，以碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺類化合物為基質(zhì)的微生物受到抑制，以羧酸、酚酸類化合物為基質(zhì)的微生物得到提高。通過末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)酸桿菌門變化較大。

綜上所述，隨著種植年限增加，穿心蓮根際土壤微生物功能多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這些因素共同作用是導(dǎo)致穿心蓮連作障礙形成的主要原因。添加生物炭后，在相同種植年限的水平上比較，細(xì)菌、放線菌數(shù)量增加，真菌數(shù)量減少，Shannon、McIntosh指數(shù)增加，以羧酸、酚酸類化合物為基質(zhì)的微生物得到抑制，酸桿菌門的細(xì)菌數(shù)量減少。穿心蓮連作障礙得到緩解，連作2 a加炭的整體情況優(yōu)于連作1 a不加炭。

本研究初步探討了連作0-2 a穿心蓮的大田試驗(yàn)，年限較短，后期還需延長年限進(jìn)一步深入研究。