林建奇 劉海濤 甄長偉 王 威 藍(lán) 圖 姚夢楠

(1北京海光儀器有限公司，北京 100015；2中國地質(zhì)裝備集團(tuán)有限公司，北京 100102)

前言

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)和消費大國。自從生猛海鮮紛紛上餐桌之后，基圍蝦便成了我們口腹之中的“?？汀??；鶉r生于咸淡水交界處，是一種近岸淺海蝦類，能耐低氧，具有潛底習(xí)性，雜食性強，以污泥藻類等為食[1-3]。隨著高密度集約化養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到迅猛發(fā)展，水產(chǎn)品質(zhì)量安全也越來越得到重視和關(guān)注[4-6]。LEMLYAD[7]通過全球環(huán)境安全研究，得出水產(chǎn)品可以通過對水中的砷、汞、鎘、鉛等重金屬進(jìn)行蓄積，進(jìn)而危害人體健康。

目前，砷元素作為食品衛(wèi)生安全管控指標(biāo)之一，正是由于其毒理特殊性。最常見的砷化合物為砷的氫化物或胂、五氧化二砷和三氧化二砷，及其對應(yīng)的水化物為砷酸和亞砷酸。一些重要的生物砷化合物：一甲基胂、二甲基胂、三甲基胂、甲基胂酸、二甲基次胂酸等。其中，無機砷的毒性最強[7]。而基圍蝦作為強雜食性物種，極容易蓄積各種形態(tài)的砷化合物。為了客觀地反應(yīng)總砷的含量，GB5009.11—2014規(guī)定食品中總砷及無機砷的測定，主要方法有：電感耦合等離子體質(zhì)譜法、氫化物發(fā)生原子熒光光譜法、銀鹽法[8]。國家標(biāo)準(zhǔn)采用濕法消解和干灰化法對樣品進(jìn)行消解，而戚榮平等[9-10]均做過對海產(chǎn)品的不同處理，由于有機砷耐熱性強，所以濕化學(xué)消解很難徹底將其解離；而干灰化法處理高蛋白的基圍蝦，易出現(xiàn)劇烈燃燒噴濺。二者處理方法均使得測定結(jié)果偏低。因此，單純使用其中方法之一很難準(zhǔn)確、徹底地測定總砷含量[9-11]。根據(jù)實際情況，結(jié)合濕法消解法和干灰化法對基圍蝦樣品進(jìn)行消解，可較好地解決基圍蝦樣品消解不完全的問題，同時采用高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀對單一濕法消解液和混合消解液進(jìn)行砷形態(tài)分析，考察差異性。本文建立了濕法消解/干灰化混合前處理方法，可將基圍蝦樣品中的有機砷全部轉(zhuǎn)化為無機砷，實現(xiàn)氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法準(zhǔn)確、可靠地測定基圍蝦樣品中總砷。

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

AFS-9560雙道四燈全自動原子熒光光譜儀 (北京海光儀器有限公司)，LC-AFS-9560高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀(北京海光儀器有限公司)，PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)陰離子交換柱(瑞士哈密爾頓公司)，0.45 μm微孔濾膜(天津津騰公司)，砷空心陰極燈(北京有色金屬研究院)，SECURA224-1CN(萬分之一)電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，UPW-20N超純水機(北京歷元儀器公司)，LK-2000A粉粹機(新昌縣城關(guān)紅利數(shù)控廠)，EH35A plus電熱板(北京萊伯泰科有限公司)。

砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：砷甜菜堿(GBW08670)、砷酸根(GBW08667)、亞砷酸根(GBW08666)、一甲基砷(GBW08668)、二甲基砷(GBW08669)均購自中國計量科學(xué)研究院。

砷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：砷元素單標(biāo)(GBW08611)均購自中國計量科學(xué)研究院。

鹽酸、硫酸、硝酸為優(yōu)級純；硼氫化鉀、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫脲、氧化鎂、硝酸鎂為分析純；分析用水為超純水；氬氣純度為99.99%。

還原劑：稱取硼氫化鉀10 g、氫氧化鈉2.5 g用超純水溶解，定容至500 mL，混勻。

載流：量取100 mL鹽酸，加入900 mL超純水，混勻即為鹽酸(10%)溶液。

硫脲溶液：稱取10 g硫脲，加入100 mL超純水，混合即為硫脲溶液(100 g/L)。

所用器皿均采用硝酸溶液(20%)浸泡，并清洗干凈烘干。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

通過逐級稀釋砷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配制成1 mg/L的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液。取25 mL比色管，先加入1.25 mL鹽酸以及2.5 mL硫脲溶液，最后加入一定量的1 mg/L砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，純水定容，搖勻，配制成0、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3 儀器工作條件

原子熒光光譜儀條件：光電倍增管負(fù)高壓280 V；砷空心陰極燈電流60 mA (主電流) 30 mA(輔電流)；讀數(shù)時間16 s，延遲時間3 s；原子化器高度9.0 mm；氬氣流量：載氣400 mL/min，屏蔽氣900 mL/min；蠕動泵轉(zhuǎn)速60 r/min；還原劑為氫氧化鈉(5 g/L)+硼氫化鉀(20 g/L)；載流鹽酸(5%)。

熱消解條件：電熱板預(yù)消解，50 ℃保持20 min，100 ℃保持30 min，160 ℃保持3 h；馬弗爐灰化，300 ℃保持3 min，550 ℃保持6 min。

高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀條件：光電倍增管負(fù)高壓300 V；砷空心陰極燈電流60 mA (主電流)，30 mA(輔電流)；原子化器高度9.0 mm；氬氣流量：載氣400 mL/min，屏蔽氣900 mLmin；蠕動泵轉(zhuǎn)速70 r/min。流動相：磷酸二氫鉀(10 mmol/L)和磷酸氫二鈉(1 mmol/L)，流速1 mL/min；進(jìn)樣量100 μL；還原劑氫氧化鈉(5 g/L)+硼氫化鉀(40 g/L)；載流鹽酸(10%)。

1.4 樣品前處理

蝦樣選自大型超市和農(nóng)貿(mào)市場。取新鮮蝦，剝掉蝦頭和蝦殼，于冰箱冷凍。采用粉粹機將冷凍的蝦粉粹均勻。采用塑封袋密封，冰箱冷藏，備用。

1.5 樣品灰化

取0.1 g(精確至0.000 1 g)蝦樣于50 mL石英坩堝，加入6 mL硝酸，蓋上表面皿靜置冷消解120 min。置于電熱板上，50 ℃保持20 min，100 ℃保持30 min，160 ℃保持3 h至消解液成微黃色澄清。取掉表面皿，160 ℃趕酸至消解液約1 mL，加入2 mL硝酸鎂溶液(500 g/L)，繼續(xù)趕酸至蒸干。之后，蓋上石英坩堝蓋，移入馬弗爐，300 ℃保持3 min，650 ℃保持6 min。取出冷卻，加入鹽酸溶液(5%)溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL的比色管中，加入2.5 mL硫脲溶液，最后鹽酸溶液(5%)定容，搖勻待測。同時做試劑空白實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫化物發(fā)生條件優(yōu)化

氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法作為元素分析的測試手段，利用蠕動泵或者注射泵實時將還原劑、樣品以及載流引入反應(yīng)模塊進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，在載氣氬氣的作用下，將反應(yīng)產(chǎn)生的氣態(tài)砷化氫導(dǎo)入原子化器檢測?；趧討B(tài)反應(yīng)流路機理，進(jìn)樣需要平穩(wěn)，而且一定濃度的還原劑和載流關(guān)系著反應(yīng)的徹底、完整和穩(wěn)定性，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)化的靈敏度。原子熒光光譜儀部分采取載氣流量400 mL/min，屏蔽氣流量900 mL/min，還原劑濃度為氫氧化鈉(5 g/L)+硼氫化鉀(20 g/L)；載流選擇鹽酸作為主要反應(yīng)酸介質(zhì)，酸度為鹽酸(5%)[12-13]。

2.2 樣品消解方式選擇

傳統(tǒng)意義上，樣品的消解方式主要為濕法消解和干灰化消解[11]。針對富含蛋白質(zhì)和高有機質(zhì)的蝦樣品，分別采用以下方式處理，研究消解方式對于蝦樣品的測定影響(稱樣量為0.1 g)。

2.2.1 濕法消解

往樣品中加入5 mL硝酸和2 mL硫酸，靜置冷消解2 h，電熱板上50 ℃保持20 min，100 ℃保持30 min，180 ℃保持1 h，300 ℃保持2 h至消解液澄清淡黃色，冷卻轉(zhuǎn)移，待測。

2.2.2 干灰化法消解

將樣品于電熱板上100 ℃進(jìn)行干燥去除水分，加入2 mL硝酸鎂溶液(500 g/L)，繼續(xù)蒸干。移入馬弗爐，150 ℃保持2 min，300 ℃保持5 min，550 ℃保持5 min。取出冷卻，加入鹽酸溶液溶解干灰，轉(zhuǎn)移，待測。

2.2.3 濕法-干灰化消解

按樣品灰化處理方法進(jìn)行處理，待測。

將以上不同的消解方式，同時上機測定，得出差異如圖1所示。明顯地，濕法/干灰化消解的測定結(jié)果最高。在消解過程，雖然濕法消解加入高沸點的硫酸提高電熱板極限溫度進(jìn)行消解，但是部分有機砷的高耐熱性，仍然未能完全徹底消解蝦樣品。而高蛋白質(zhì)和有機質(zhì)的蝦樣，通過蒸干方式，直接進(jìn)入馬弗爐高溫燃燒，實驗過程出現(xiàn)爆燃飛濺現(xiàn)象，導(dǎo)致樣品損失，所以純粹的干灰化法測定結(jié)果最低。

圖1 不同消解方式對檢測結(jié)果的影響Figure 1 Influence of different digestion methods on test results.

2.3 濕法/干灰化消解對樣品中砷形態(tài)的影響

將基圍蝦樣品進(jìn)行砷形態(tài)提取[14-15]，以及對不同樣品消解方式所得的消解液，采用0.45 μm微孔濾膜過濾。采用高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀測定提取液和消解液中五種砷形態(tài)：砷甜菜堿(AsB)、三價砷(AsⅢ)、DMA(二甲基胂)、MMA(一甲基胂)、五價砷(AsⅤ)。由圖2得出，基圍蝦樣中含有大量的有機砷，而無機砷相對很少。而且，不同的消解方式均對不同的砷形態(tài)產(chǎn)生一定的影響，濕法消解還存在相當(dāng)量的有機砷沒有徹底消解，干灰化法雖然爆燃損耗，但是基本都轉(zhuǎn)化為五價砷，濕法/干灰化消解均將所有砷形態(tài)轉(zhuǎn)化為無機砷，且均被氧化為五價砷。

圖2 不同消解方式對基圍蝦樣品中的砷形態(tài)影響Figure 2 Effects of different digestion methods on arsenic morphology in shrimp samples.

2.4 輔助灰化劑的影響

由于砷在高溫615 ℃時，容易升華損失。那么，在馬弗爐灰化過程，為了避免砷元素的揮發(fā)損失，在樣品中加入輔助灰化劑如硝酸鎂、氧化鎂等。為了研究不同灰化劑對測定的影響，實驗了樣品直接灰化、樣品加入硝酸鎂再灰化、樣品加入氧化鎂再灰化、樣品同時加入硝酸鎂和氧化鎂再灰化。通過不同的灰化處理，測定結(jié)果如圖3所示，樣品加硝酸鎂和樣品加硝酸鎂、氧化鎂的測定結(jié)果濃度最高，二者差別不大。顯然，氧化鎂在基圍蝦樣品的灰化過程作用不大，但是硝酸鎂起到關(guān)鍵作用，明顯遏制了砷的揮發(fā)，為準(zhǔn)確的總砷測定提供保障。實驗采用在基圍蝦樣品中加入硝酸鎂作為輔助灰化劑。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及方法檢出限

在此優(yōu)化條件下，砷元素的熒光靈敏度IF與濃度C在質(zhì)量濃度0.0～20.0 μg/L范圍內(nèi)成線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為IF=184.62C-5.96，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 6。連續(xù)測定11次樣品空白(樣品空白為取一定量超純水，和樣品保持一致的處理過程)，對樣品空白熒光強度進(jìn)行計算SD，根據(jù)DL=3×SD/K(K是標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)計算。經(jīng)過測定，空白熒光值分別為2.36、4.35、1.86、0.25、5.26、1.12、0.46、2.38、3.45、2.15、3.26，計算檢出限為0.025 μg/L。

圖3 輔助灰化劑的影響Figure 3 Influence of auxiliary ashing agent.

2.6 方法精密度

分別對每個基圍蝦樣品平行處理7次，并對這7個樣品進(jìn)行測定，計算方法的精密度(見表1)。結(jié)果表明，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在2.5%～3.1%。精密度結(jié)果較佳，確保方法的穩(wěn)定、可靠性。

表1 方法精密度實驗Table 1 Method precision experiment(n=7)

2.7 加標(biāo)回收實驗

按精密度測定基圍蝦樣品結(jié)果，取平均值，分別對3個樣品加標(biāo)5 μg/L和10 μg/L，結(jié)果見表2，計算得到的加標(biāo)回收率范圍為93.6%～103%，方法準(zhǔn)確。

表2 加標(biāo)回收實驗Table 2 Labeling recovery experiment

2.8 方法準(zhǔn)確性實驗

取GBW08572對蝦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成分，作為本方法的準(zhǔn)確性驗證對象。按濕法/干灰化法，依次對對蝦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行處理，平行處理3份，測定結(jié)果見表3。測定值基本在標(biāo)準(zhǔn)值范圍，偏差很小，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測試Table 3 Test of standard substance

3 結(jié)論

采用濕法消解/干灰化法-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定基圍蝦中總砷的方法。在優(yōu)化條件下，樣品加入硝酸經(jīng)電熱板預(yù)消解后進(jìn)行馬弗爐干灰化處理，確保將基圍蝦中的有機砷全部轉(zhuǎn)化為無機砷，同時避免實驗過程中砷元素的損失。在此過程研究了不同消解方式對基圍蝦中砷形態(tài)的影響，濕法消解/干灰化法處理基本可以將所有的砷形態(tài)轉(zhuǎn)化為無機砷。方法準(zhǔn)確、可靠，有效克服了高蛋白質(zhì)以及富含有機質(zhì)的基圍蝦在消解過程中很難將所有有機砷轉(zhuǎn)為無機砷的困難，可適用于基圍蝦等其他海產(chǎn)品的總砷測定。