關愛華 蔡 勇 孫 瑜 李萬鋒

(吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，長春 130012)

乳腺癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率中位居首位，是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因參與、多步驟演進的復雜過程，目前其發(fā)病機制尚未完全闡明[1]。腫瘤轉移是腫瘤致死的主要原因，因此，預防和抑制腫瘤轉移至關重要。

免疫檢測點分子是腫瘤免疫學研究的熱點之一。CD276屬于免疫檢查點分子的B7超家族，其在大多數(shù)正常組織中低表達，但在各種癌組織，包括乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結腸癌等則異常高表達[2,3]，且其高表達與乳腺癌、宮頸癌、腎癌等有較差的預后相關[4-6]。但CD276對腫瘤細胞生物學特性所產(chǎn)生的影響及其確切機制尚不十分清楚。鑒于CD276的表達與腫瘤分級及遠端轉移相關，推測CD276可能與腫瘤細胞侵襲能力相關。

本文在乳腺上皮細胞系MCF-10A中過表達CD276，在乳腺癌細胞系T-47D中敲低CD276的表達，研究過表達或敲低CD276的表達對細胞遷移和侵襲的影響及其初步的作用機制，從而為闡明CD276的生物學作用奠定基礎，以期為乳腺癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-10A和T-47D細胞系購自上海細胞研究所細胞庫，并由本院中心實驗室傳代培養(yǎng)。CD276真核表達載體pcDNA3-CD276和pRNAT-CD276shRNA(CD276shRNA sequence:5′-GTGCTGGAGAAAGATCAAA-3′)由東北師范大學藥物基因和蛋白篩選國家工程實驗室饋贈。Snail、Slug和E-cadherin抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司，抗CD276抗體購自RB公司,抗GAPDH抗體購自上?？党缮镉邢薰?，HRP標記的第二抗體購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。PVDF膜購于羅氏公司。預染蛋白分子量標準購于碧云天生物技術研究所。ECL發(fā)光試劑盒購自全式金公司。BrdU試劑盒購自Roche Diagnostics (Mannheim，Germany)。細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。MTT購自Amresco公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma-Aldrich公司。國產(chǎn)新生牛血清購自杭州四季青生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MCF-10A細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 μg/ml的鏈霉素和100 U/ml的青霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。T-47D 細胞所用培養(yǎng)基為含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10 μg/ml 胰島素的 1640培養(yǎng)基。

1.2.2細胞轉染 在轉染前一天將MCF-10A或T-47D 細胞培養(yǎng)于6孔細胞板中，24 h后將質(zhì)粒按3 μg/孔加入到100 μl無血清的DMEM或1640培養(yǎng)基中，充分混勻。然后加入5 μl的轉染試劑，混勻，室溫靜置30 min后，將混合液加入到6孔板中。在含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，然后進行換液。在不同培養(yǎng)時間進行相應的檢測。

1.2.3細胞劃痕實驗 在MCF-10A或T-47D 細胞中分別轉染pcDNA3空載體和pcDNA3-CD276重組載體，轉染 48 h后，將兩組細胞鋪于24孔板中，用10%新生牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)16～24 h，使其形成單層細胞，用10 μl移液槍槍頭在單層細胞上劃痕，用PBS緩沖液清洗3次，洗去漂浮細胞，換成10%新生牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在0 h、24 h時倒置顯微鏡下拍照觀察細胞生長遷移情況。

1.2.4Transwell 實驗 4℃過夜融化基質(zhì)膠，并用預冷的不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基按1∶3稀釋基質(zhì)膠，使其終濃度達到1 mg/ml。將Transwell 小室放置于24孔板上，并加入100 μl稀釋的基質(zhì)膠，37℃孵育 4 h 使膠完全凝固。用含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基制備細胞懸液，計數(shù)，上室加入 0.5×105個細胞/孔，并在Transwell的下室加 600 μl 正常的 DMEM培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2孵育箱培養(yǎng)，40 h后從24孔細胞板中取出Transwell小室，PBS洗滌后用4%的多聚甲醛固定細胞30min，PBS 洗 3 次。用棉簽除去Transwell小室上未能侵入的細胞。0.5%TritonX-100作用5 min，PBS洗3次；用蘇木精對細胞核染色10 min，水沖洗；弱氨水10 s浸泡，水沖洗；伊紅細胞質(zhì)染色3 min，洗凈。顯微鏡下隨機選取不同的視野計數(shù)。

1.2.5Western blot 將培養(yǎng)細胞用胰酶消化后收集到離心管內(nèi)，4 000 r/min離心5 min；用PBS洗滌細胞3次，4 000 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入適量細胞裂解液冰上裂解，每隔5 min劇烈渦旋20 s，使細胞充分裂解，渦旋60 min后12 000 r/min離心5 min，收集上清至另一新的離心管中，加入適量的蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮沸8 min，用10% SDS-PAGE電泳，電泳結束后，在100 V恒壓條件下將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉移至PVDF膜上；將PVDF膜用含有0.2%Tween20的TBS緩沖液(TBST)洗滌3次，用含有5%脫脂奶粉的TBST 37℃封閉30 min；TBST洗滌3次后將第一抗體用TBST緩沖液稀釋后，與PVDF膜一同裝入雜交袋中，4℃過夜；用TBST緩沖液洗滌3次；將HRP標記的二抗用TBST緩沖液稀釋后，與PVDF膜一同裝入新的雜交袋中，室溫搖床上放置30 min或者1 h；TBST緩沖液洗滌3次；最后進行ECL發(fā)光檢測。

2 結果

2.1CD276在正常乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞中的表達 為了了解CD276在正常乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞中的表達情況，我們利用Western blot方法檢測了CD276在乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞中的表達。結果如圖1所示，CD276在乳腺上皮細胞MCF-10A中呈低表達，但在乳腺癌細胞T-47D中呈高表達。

圖1 CD276在正常乳腺細胞及乳腺癌細胞的表達分析Fig.1 Expression of CD276 in normal breast cells and cancer cells

2.2在乳腺上皮細胞中過表達CD276及在乳腺癌細胞中敲低CD276表達的鑒定 在MCF-10A細胞中分別瞬轉pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達載體，在T-47D細胞中分別瞬轉pRNAT空載體和pRNAT-CD276shRNA載體，之后對CD276的過表達及敲低情況進行了鑒定。結果如圖2所示，在MCF-10A細胞中瞬轉pcDNA3.0-CD276真核表達載體后明顯增加了CD276的表達，而在T-47D細胞中瞬轉pRNAT-CD276shRNA載體可明顯抑制CD276的表達。

圖2 CD276過表達及敲低的效果鑒定Fig.2 Identification efficiency of CD276 overexpression and knocking down

2.3CD276對乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞遷移能力的影響 在MCF-10A細胞中分別瞬轉pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達載體，之后進行劃痕實驗。結果如圖3A所示，過表達CD276后明顯增強了MCF-10A細胞的遷移能力。在T-47D細胞中分別瞬轉pRNAT空載體和pRNAT-CD276shRNA載體，之后進行劃痕實驗。結果如圖3B所示，敲低CD276的表達明顯抑制了T-47D細胞的遷移能力。

圖3 劃痕法檢測CD276對細胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of CD276 on cell migration was detected by wound healing assayNote:A.Effect of CD276 overexpression on the migration of MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the migration of T-47D cells.

2.4CD276對乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞侵襲能力的影響 在MCF-10A中分別瞬轉pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達載體，之后進行Transwell實驗。結果如圖4A所示， 過表達CD276后明顯促進了乳腺上皮細胞的侵襲能力。在T-47D細胞中分別瞬轉pRNAT空載體和pRNAT-CD276shRNA載體，之后進行Transwell實驗。結果如圖4B所示，敲低CD276的表達明顯抑制了乳腺癌細胞的侵襲能力。

圖4 Transwell法檢測CD276對細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of CD276 on cell invasion was detected by Transwell assayNote:A.Effect of CD276 overexpression on the invation of MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the invation of T-47D cells.

2.5CD276對侵襲相關蛋白表達的影響 在MCF-10A腫瘤細胞中，分別瞬轉pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達載體，于轉染48 h后收集細胞， 提取蛋白，通過Western blot方法檢測周期相關蛋白。結果如圖5A所示，在MCF-10A細胞中過表達CD276可抑制侵襲相關蛋白E-cadherin的表達，促進Snail和Slug的表達。在T-47D腫瘤細胞中，分別瞬轉pRNAT空載體和pRNAT-CD276sh RNA真核表達載體，于轉染48 h后收集細胞，提取蛋白，通過Western blot方法檢測周期相關蛋白。結果如圖5B所示，在T-47D細胞中敲低CD276的表達可促進侵襲相關蛋白E-cadherin的表達，抑制Snail和Slug的表達。

圖5 Western blot方法檢測CD276對細胞中侵襲相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of CD276 on expression of cell invasion related proteins were detected by Western blot analysisNote:A.Effect of CD276 overexpression on the expression of invation related proteins in MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the expression of invation related proteins in T-47D cells.

3 討論

乳腺癌是威脅全球女性健康最主要的疾病之一，目前盡管已經(jīng)開發(fā)了更有效的細胞毒性藥物、激素和抗Her2治療乳腺癌的方法，但轉移性乳腺癌仍無法治愈[7]，因此仍需要進一步解析乳腺癌轉移的機制，以便為乳腺癌提供新的治療靶點。

CD276屬于免疫檢查點分子的B7超家族，其在大多數(shù)正常組織中低表達，但在各種癌癥，包括乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌等組織中明顯高表達[5,6]。大量研究表明，CD276過表達與胰腺、乳腺、結直腸、肝臟、前列腺癌、肝內(nèi)膽管癌、口腔鱗癌的增殖和侵襲潛能相關[8,9]。在許多癌癥中，CD276的過表達與較差的預后相關[10,11]。但是，在胃癌和胰腺癌患者中，高表達CD276則與更好的生存率密切相關[12,13]。導致這種差異可能與不同的癌癥類型(或亞型)、腫瘤異質(zhì)性、不同的樣本量、臨床分期、CD276測定的時間點以及研究中使用的不同方法有關。

轉移侵襲是惡性腫瘤的基本特征和重要標志，也是導致患者死亡的最主要原因。研究表明，超過80%的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉移。鑒于此，本研究主要著眼于CD276對乳腺癌細胞轉移的影響。

腫瘤轉移首先表現(xiàn)為細胞遷移和侵襲能力增強。因此，在本文中，我們首先通過劃痕法檢測了過表達或敲低CD276的表達對細胞遷移能力的影響。結果顯示，過表達CD276蛋白可明顯增強正常乳腺上皮細胞MCF-10A的遷移能力，而敲低CD276的表達則可明顯抑制乳腺癌細胞T-47D的遷移能力。Transwell結果顯示，過表達CD276蛋白可明顯增強正常乳腺上皮細胞MCF-10A的侵襲能力，而敲低CD276的表達則可明顯抑制乳腺癌細胞T-47D的侵襲能力。由此我們推測，CD276可促進細胞的遷移及侵襲，并進而促進腫瘤的轉移。

上皮-間質(zhì)轉化(Epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)被認為是腫瘤進展和轉移的關鍵步驟[14]。上皮細胞通過EMT獲得間充質(zhì)特性，使腫瘤細胞能夠克服內(nèi)皮屏障，通過血液或淋巴循環(huán)向其他器官遷移[15]。在EMT過程中，細胞丟失上皮標志因子，如E-cadherin等，而相關轉錄因子包括Slug、Twist、Snail等家族會被激活[16]。Snail 家族成員 Snail1 和 Snail2(Slug)等參與了與細胞分化和生存相關的各種過程，對于腫瘤發(fā)生起重要作用。Snail 是可直接抑制 E-鈣黏蛋白轉錄的重要因子，可誘導 EMT的發(fā)生[17,18]。Snail1 及 Slug 能夠抑制 E-鈣黏蛋白表達。為了進一步闡明CD276促進細胞的遷移及侵襲的機制，我們通過Western blot方法檢測了CD276對E-cadherin、Snail及Slug表達的影響。結果顯示，在MCF-10A細胞中過表達CD276可抑制侵襲相關蛋白E-cadherin的表達，促進Snail和Slug的表達；而在T-47D細胞中敲低CD276的表達可促進侵襲相關蛋白E-cadherin的表達，抑制Snail和Slug的表達。

本研究結果提示，CD276蛋白除了在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，還可通過促進EMT增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究可以為進一步研究CD276的功能奠定實驗基礎，同時也將為乳腺癌轉移的治療提供新的靶點。