李欣益 劉春妍 黃 建 顏 妍 謝基明 王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),呼和浩特 010018)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種較為普遍的慢性肝病，病理表現(xiàn)為脂肪變性和脂質(zhì)沉積。由于肥胖，缺乏運(yùn)動(dòng)以及不健康的飲食習(xí)慣導(dǎo)致了NAFLD在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[1,2]。NAFLD包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，有的甚至可能發(fā)展為肝癌[3,4]。現(xiàn)有研究表明NAFLD的治療方法主要包括噻唑烷二酮類(lèi)、二甲雙胍、鹽酸小柴堿等藥物性手段，但該類(lèi)藥物的副作用較大，難以實(shí)現(xiàn)安全性的治療；而改善生活方式，培養(yǎng)科學(xué)的飲食，加強(qiáng)鍛煉等非藥物手段又難以實(shí)現(xiàn)高效的治療[5]。因此，探究更安全有效的治療方式成為關(guān)注的熱點(diǎn)。益生菌V9(Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9)是從12位健康的蒙古族兒童糞便中分離得到31株雙歧桿菌中篩選出來(lái)的一株具備豐富益生活性的雙歧桿菌[6]。它具有抗炎和抗氧化、降低膽固醇和血壓、增強(qiáng)免疫力等功能[7]。在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中，國(guó)外研究者提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)已經(jīng)成為解釋該病發(fā)生的主要理論，“一次打擊”主要是指胰島素抵抗以及脂質(zhì)代謝紊亂造成肝細(xì)胞的變性；“二次打擊”是指在“一次打擊”的基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[8,9]。本實(shí)驗(yàn)則以“二次打擊”為理論基礎(chǔ)，探究益生菌V9抑制NAFLD大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)、緩解脂代謝紊亂，改善NAFLD大鼠的肝損傷情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 120 g左右的Wistar雄性大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h,保持溫度20～26℃，濕度40%～60%，隨意進(jìn)食與飲水。高脂飼料含脂肪33.1%、普通飼料含脂肪11.4%，均由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供。

1.1.2主要試劑 益生菌雙歧桿菌V9由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；黃連素購(gòu)自阿拉丁試劑公司；MDA、SOD、TC試劑盒由南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)；抗體分別為SOD2(編號(hào)：Lot#10002)，PPAR-γ(編號(hào)：LotNO.821800535)，β-actin(編號(hào)：Lot#4967S),均由美國(guó)Cell Signaling公司提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建 40只Wistar雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為空白組和模型組。模型組喂食高脂飼料，空白組喂食普通飼料，連續(xù)喂食6周后，將模型組隨機(jī)分為高脂飲食組(HFD)，黃連素Berberine 組(HFD+BR)，益生菌V9治療組(HFD+V9)，益生菌V9對(duì)照組(V9)4組，并且將高脂飼料換成普通飼料。根據(jù)大鼠的體重進(jìn)行灌胃給藥，給藥劑量為黃連素300 mg/kg,益生菌V9 1×109CFU/ml，空白組給予對(duì)應(yīng)的生理鹽水。4周后，進(jìn)行心臟取血，處死大鼠并收集肝臟。

1.2.2血清中AST、ALT的檢測(cè) 離心稀釋后的血清送至內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3HE染色觀察肝臟組織的病理學(xué)變化 取部分肝臟組織用10%的甲醛固定，使用酒精脫水、二甲苯進(jìn)行透明，浸蠟包埋后制片，采用蘇木精-伊紅染色法，在顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)變化。

1.2.4血清、肝組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 血清及肝組織中MDA、SOD、TC含量均使用南京建成生物工程試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體檢測(cè)方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOD2和PPAR-γ蛋白的表達(dá)含量 大鼠肝組織破碎勻漿，4℃，12 000 r/min離心10 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，加樣后，濃縮膠80 V，分離膠120 V，120 min，電泳。利用濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件為2 h，110 V。將PVDF膜放于5%的脫脂奶粉中封閉4 h。孵育一抗，TBST洗滌后，孵育二抗，再次清洗后，利用底物顯色法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6Real-time PCR檢測(cè)基因PPAR-α的mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取大鼠肝組織的總RNA，測(cè)定RNA濃度，要求OD260/280的值在1.8～2.0之間并將抽提到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。按照公式2-ΔΔct進(jìn)行計(jì)算，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of Real-time PCR

2 結(jié)果

2.1益生菌V9對(duì)血清中ALT、AST水平的影響 機(jī)體的肝功能檢測(cè)指標(biāo)主要指AST和ALT，當(dāng)肝功能受到損傷時(shí)，兩種轉(zhuǎn)氨酶水平會(huì)升高。通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，與Control組相比，HFD組的ALT、AST水平顯著升高(P<0.05)，而V9對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明益生菌V9是安全可用的；與HFD組相比，HFD+V9和Berberine組的ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明益生菌V9可以改善HFD誘導(dǎo)的肝損傷。

圖1 益生菌V9對(duì)血清中ALT、AST水平的影響Fig.1 Effects of Probiotic V9 on serum levels of ALT and ASTNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

2.2益生菌V9對(duì)病理學(xué)組織的影響 通過(guò)HE染色，觀察大鼠肝臟組織的情況，結(jié)果如圖2所示，Control組的肝細(xì)胞正常，細(xì)胞核并沒(méi)有損傷情況(圖2A)；與Control組相比，HFD組的肝細(xì)胞發(fā)生腫脹、壞死，細(xì)胞核破裂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及存在壞死灶現(xiàn)象(圖2B);HFD+V9和Berberine組的肝細(xì)胞損傷情況以及炎癥反應(yīng)與HFD組相比明顯減輕(圖2C、D)；V9組的肝組織情況與Control組相似(圖2E)。說(shuō)明益生菌V9能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷情況并對(duì)肝組織有一定保護(hù)作用。

圖2 益生菌V9作用后對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷組織學(xué)的緩解Fig.2 Histological mitigation effect of V9 on HFD induced liver injuryNote:A.Control group;B.HFD group;C.Berberine group;D.HFD+V9 group;E.V9 group.

2.3益生菌V9對(duì)血清和肝臟組織中MDA水平的影響 丙二醛MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，其濃度的大小通?？梢苑从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的高低。使用試劑盒測(cè)定MDA的水平，測(cè)定結(jié)果如圖3所示，在血清和肝臟組織中，V9對(duì)照組的MDA水平接近于Control組，但HFD組的MDA水平顯著高于Control組(P<0.05)，說(shuō)明HFD組的過(guò)氧化程度較高；HFD+V9組和Berberine的MDA水平顯著低于HFD組(P<0.05)，證明益生菌V9可以抑制MDA水平的升高，緩解機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

圖3 益生菌V9對(duì)血清和肝臟組織中MDA水平的影響Fig.3 Effects of Probiotic V9 on levels of MDA in serum and liverNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

2.4益生菌V9對(duì)于血清和肝臟組織中SOD、SOD2表達(dá)的影響 超氧化物歧化酶SOD和SOD2能夠清除機(jī)體內(nèi)的超氧化物自由基的毒害能力，維持機(jī)體氧化與抗氧化的平衡，因此測(cè)定SOD、SOD2的表達(dá)情況可以觀察益生菌V9是否具有抗氧化的能力。使用試劑盒測(cè)定SOD的活力，結(jié)果如圖4所示，在大鼠的血清和肝臟中，HFD組的SOD活力與Control組相比，顯著降低(P<0.05)，V9對(duì)照組表達(dá)正常；Berberine和HFD+V9組的SOD活力與HFD組相比，顯著升高(P<0.05)(圖4A、B)。通過(guò)Western blot分析肝臟中SOD2的表達(dá)情況，與Control組相比，HFD組的SOD2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，可能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)于益生菌V9產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致V9對(duì)照組的SOD2表達(dá)高于Control組；Berberine與益生菌V9治療后，SOD2的表達(dá)量顯著增高(P<0.05)(圖4C、D)，說(shuō)明益生菌V9具有一定的抗氧化能力。

圖4 益生菌V9對(duì)血清和肝臟組織中SOD以及SOD2的影響Fig.4 Effects of Probiotic V9 on activity of SOD，SOD2 in serum and liverNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

2.5益生菌V9對(duì)于糖脂代謝的影響 總膽固醇TC是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇的總和，其濃度可以作為檢測(cè)糖脂代謝的指標(biāo)，若TC值偏高則說(shuō)明人體的肝臟組織開(kāi)始發(fā)生病變。使用試劑盒測(cè)定TC的含量，結(jié)果如圖5所示，與Control組相比，V9對(duì)照組表達(dá)正常，HFD組的血清和肝臟組織中TC含量顯著升高(P<0.05)；與HFD組相比，Berberine和HFD+V9組的TC含量顯著下降(P<0.05)(圖5A、B)，證明益生菌V9可以緩解肝臟組織中的病變情況。

圖5 益生菌V9對(duì)于糖脂代謝的影響Fig.5 Effects of probiotic V9 on glucolipid metabolismNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

過(guò)氧化物酶增殖激活受體PPAR-α和PPAR-γ是核受體超家族成員,二者參與肝脂肪代謝和脂肪細(xì)胞的分化。利用Real-time PCR法檢測(cè)PPAR-α的mRNA水平，結(jié)果如圖5C所示，V9對(duì)照組表達(dá)正常，HFD組PPAR-α的mRNA水平顯著低于Control組(P<0.05)；Berberine和HFD+V9組PPAR-α表達(dá)量與HFD組相比顯著升高(P<0.05)。通過(guò)Western blot分析可知，與Control組相比，HFD組的PPAR-γ表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Berberine和益生菌V9治療后，PPAR-γ表達(dá)情況顯著升高(P<0.05)(圖5D、E)，證明益生菌V9促進(jìn)了PPAR-α和PPAR-γ的表達(dá)。

3 討論

NAFLD是一種常見(jiàn)的慢性肝病，因其廣泛性、高發(fā)性已經(jīng)成為我國(guó)的第二大慢性肝病[10]。對(duì)于這種發(fā)病機(jī)理復(fù)雜且與各種因素有關(guān)的疾病，仍然沒(méi)有較為準(zhǔn)確的理論解釋它的發(fā)生[11]。本實(shí)驗(yàn)以第二次打擊“炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)”[12]為理論依據(jù)，建立NAFLD的模型，研究益生菌雙歧桿菌V9對(duì)NAFLD大鼠肝功能、氧化應(yīng)激以及脂代謝的影響。為了觀察NAFLD大鼠的肝細(xì)胞是否發(fā)生損傷以及損傷程度，即測(cè)定了血清中ALT和AST的水平，發(fā)現(xiàn)HFD組的ALT、AST水平顯著高于Control組，說(shuō)明HFD組的肝功能受損，但是益生菌V9和Berberine治療后，緩解了NAFLD大鼠的肝功能受損情況。

益生菌是一種通過(guò)調(diào)節(jié)宿主微生態(tài)系統(tǒng)平衡對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響的活性微生物[13]。已有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)益生菌可以作為一種新的治療策略治療NAFLD[14,15]：如益生菌合劑憑借其對(duì)脂質(zhì)、瘦素以及炎癥標(biāo)志物的作用，治療NAFLD;口服復(fù)方益生菌可以緩解NAFLD患者的腸道微生物失調(diào)和代謝紊亂現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)則探究益生菌V9是否可以通過(guò)抗氧化途徑改善NAFLD的肝損傷情況。通過(guò)檢測(cè)血清和肝臟組織中的MDA水平，發(fā)現(xiàn)益生菌V9可以抑制MDA水平的升高，從而緩解機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。并且益生菌V9提高了機(jī)體內(nèi)SOD和SOD2的表達(dá)，證明了它具有一定的抗氧化能力。

NAFLD的發(fā)生與糖脂代謝異常緊密相關(guān)，脂代謝紊亂導(dǎo)致了肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性和脂肪沉積[16]。通過(guò)檢測(cè)血清和肝臟組織中的TC含量，發(fā)現(xiàn)HFD組的TC值偏高，證明肝臟組織有代謝紊亂的癥狀存在。PPAR-α作為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子,在代謝活性較高的組織中如肝臟、肌肉、脂肪組織等高表達(dá)[17]。通過(guò)Real-time PCR法檢測(cè)PPAR-α的mRNA水平，同時(shí)利用Western blot 分析PPAR-γ的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HFD組的PPAR-α和PPAR-γ表達(dá)受到抑制，肝脂肪代謝和脂肪細(xì)胞的分化能力下降，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝臟中發(fā)生沉積。但是益生菌V9的加入可以抑制TC含量的上升并且增強(qiáng)PPAR-α和PPAR-γ的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)NAFLD的脂代謝紊亂，減輕肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積的現(xiàn)象。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)GRK2參與小鼠和人類(lèi)非酒精性脂肪變性和脂肪性肝炎的發(fā)生[18]，抑制PDLIM2 NF-κB的活化可以阻抑高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪生成和炎癥的發(fā)生[19]，異生核受體的調(diào)節(jié)與NAFLD的產(chǎn)生有關(guān)[20]。關(guān)于NAFLD的診斷和治療，因缺乏準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)制而受到限制，所以需要更多新的治療技術(shù)和藥物。本實(shí)驗(yàn)中，益生菌V9可以作為一種更安全更新型的治療手段，但仍需要更加深入地研究其作用機(jī)制，以便更好地開(kāi)發(fā)利益生菌V9。