滕昊林 于金宇 劉 念 趙 軍 薛立娟

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外二科,長春 130021)

急性排斥反應(yīng)是影響移植腎長期存活的危險因素之一，移植排斥反應(yīng)的實質(zhì)是炎癥反應(yīng)[1，2]。白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)與其受體結(jié)合，促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子釋放，是具有多種功能的前炎性細(xì)胞因子，在細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[3，4]。研究IL-17在移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)特點及其對移植物局部損傷的作用，對于提高排斥反應(yīng)的認(rèn)識、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后具有重要作用[5，6]。

前期我們已經(jīng)通過對大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)模型的建立，分析了大鼠在急性排斥反應(yīng)發(fā)生時，IL-17在移植腎第3、5、7天的mRNA和蛋白表達(dá)情況，基本證實了IL-17在早期就參與了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，并可作為早期的獨立預(yù)測因子[7]。

本研究采用72例移植腎穿刺活檢組織標(biāo)本，觀察外周血中IL-17基因和蛋白水平的表達(dá)狀態(tài)及其在移植腎穿刺活檢組織中表達(dá)位置，探討其與移植腎急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料 PCR試劑盒、Trizol(均為日本 TaKaRa公司產(chǎn)品)，DEPC(美國Fluka公司產(chǎn)品)，IL-17特異性抗體(北京博奧森公司)，EP管、吸頭均為無 RNA 酶處理過的產(chǎn)品。

1.2方法 留取在我院行同種異體腎移植術(shù)后，72例經(jīng)病理證實急性排斥反應(yīng)患者的血液及移植腎組織穿刺標(biāo)本及部分健康志愿者血液標(biāo)本。根據(jù)穿刺病理及臨床檢查結(jié)果將患者及志愿者分為4組，正常組(Control)：健康志愿者；藥物組(CSA)：診斷為免疫抑制劑中毒；排斥組(AR)：診斷為急性排斥反應(yīng)；穩(wěn)定組(Stable)：病理未見明顯異常。分別提取志愿者及患者血液標(biāo)本RNA，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳后計算每一條目的片段與β-actin對照片段的強(qiáng)度比值，得出基因的相對表達(dá)水平，同時使用酶聯(lián)免疫法定量檢測以上4組全血中游離的IL-17蛋白水平，統(tǒng)計和分析在發(fā)生排斥反應(yīng)時各組IL-17基因和蛋白表達(dá)的差異情況。

根據(jù)移植腎病理banff分級，將移植腎穿刺病理標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步分組：急性T細(xì)胞排斥組(TCMR)；急性抗體介導(dǎo)排斥組(ABMR)；臨界改變組(Borderline changes)；未見異常組(Nonspecific changes)。分別進(jìn)行IL-17免疫組織化學(xué)染色，觀察IL-17在發(fā)生排斥反應(yīng)時與其他各組在移植腎組織中的主要表達(dá)部位及其差異特點，進(jìn)而對IL-17與TCMR組的小管炎和ABMR組的C4d沉積的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)性分布者采用單因素方差分析，計數(shù)資料組間差異采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman統(tǒng)計，相關(guān)系數(shù)用r表示。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腎移植患者IL-17基因水平的表達(dá) 腎移植患者IL-17 的基因相對表達(dá)量在正常組、藥物組、排斥組和穩(wěn)定組分別為0.837±0.108、0.705±0.094、1.452±0.071、0.812±0.129，與其他3組比較，排斥組患者IL-17基因的相對表達(dá)水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見圖1。

圖1 IL-17的基因相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of IL-17 geneNote:*.P<0.05.

2.2腎移植患者血液中的IL-17蛋白水平 酶聯(lián)免疫定量檢測結(jié)果表明，正常組、藥物組、排斥組和穩(wěn)定組分別為17.19±2.78、16.57±3.04、34.74±3.15、17.21±3.90，與其他3組比較，排斥組患者血液中的IL-17蛋白水平顯著升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖2。

圖2 IL-17的蛋白表達(dá)水平Fig.2 Protein expression level of IL-17Note:*.P<0.05.

2.3IL-17 在移植腎穿刺活檢組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，IL-17在各組移植腎穿刺活檢組織中均有不同程度表達(dá)，IL-17陽性主要定位在腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)中浸潤的炎細(xì)胞，偶表達(dá)在浸潤于腎小球的炎細(xì)胞內(nèi)，而血管上皮細(xì)胞未見IL-17表達(dá)。

IL-17在移植腎活檢組織腎小管表達(dá)情況詳見表1和圖3，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，急性T細(xì)胞排斥反應(yīng)組與未見異常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)，急性抗體介導(dǎo)排斥組和臨界改變組與未見異常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 IL-17在各組腎小管中的表達(dá)

Tab.1 Expression of IL-17 in renal tubules of each group

GroupsnIL-17+-(%)PTCMR3227584.40.02ABMR95455.60.67Borderline changes1811761.60.48Nonspecific changes136746.2-

圖3 IL-17在各組腎小管中的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-17 in renal tubules of each group

IL-17在移植腎活檢組織腎間質(zhì)表達(dá)情況詳見表2和圖4，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，急性T細(xì)胞排斥組與未見異常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，急性抗體介導(dǎo)排斥組和臨界改變組與未見異常組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 IL-17在各組腎間質(zhì)中的表達(dá)

Tab.2 Expression of IL-17 in renal interstitium of each group

GroupsnIL-17+-(%)PTCMR3226681.30.004ABMR96366.7 0.192Borderline changes1810855.60.275Nonspecific changes134930.8-

2.4IL-17表達(dá)與腎小管炎的關(guān)系 免疫組化染色結(jié)果顯示，IL-17在急性T細(xì)胞排斥反應(yīng)腎小管上皮高表達(dá)，而急性T細(xì)胞排斥反應(yīng)多有明顯小管炎形成，利用Spearman等級相關(guān)分析腎小管炎和IL-17陽性表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示IL-17表達(dá)與小管炎存在呈正相關(guān)(r=0.455，P=0.034)，見表3,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 急性T細(xì)胞排斥反應(yīng)中IL-17表達(dá)與小管炎相關(guān)性分析

Tab.3 Correlation analysis of IL-17 expression in acute T cell rejection and tubules inflammation

nIL-17+-rPBanff(t)+262420.4550.034Banff(t)-633

Note:Banff(t).Tubulitis.

2.5急性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中IL-17表達(dá)與C4d沉積的關(guān)系 進(jìn)一步分析，IL-17表達(dá)與C4d沉積的關(guān)系，Spearman等級相關(guān)分析顯示，IL-17 表達(dá)與C4d沉積呈正相關(guān)(r=0.71，P=0.001)，見表4，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 IL-17表達(dá)與C4d沉積相關(guān)性分析

Tab.4 Correlation analysis between IL-17 expression and C4d deposition

nIL-17+-rPC4d+9630.710.001C4d-909

3 討論

目前，腎臟移植是治療終末期腎臟疾病的最佳手段，隨著現(xiàn)代新型免疫抑制劑的使用，雖然降低了腎移植后發(fā)生排斥反應(yīng)的比率，但同時也增加了受者感染各種病原體的風(fēng)險[8]，這使得患者在排斥和過度免疫狀態(tài)之間動態(tài)波動，給術(shù)后移植腎功能發(fā)生改變時的明確診斷帶來困擾。移植腎穿刺活檢是診斷急性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其創(chuàng)傷性及有一定并發(fā)癥的特點，因此非創(chuàng)傷性的方法越來越受到人們的重視。Loverre等[9]在體外培養(yǎng)的人近曲小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，C3a通過JAK2磷酸化誘導(dǎo)IL-17 mRNA高表達(dá)，并提出急性排斥反應(yīng)腎小管上皮細(xì)胞是IL-17的產(chǎn)生細(xì)胞。

本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)時腎移植患者IL-17的基因水平和蛋白水平的表達(dá)均明顯高于穩(wěn)定組(P<0.05)，表明IL-17在移植腎急性排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，預(yù)示其可以作為一種新的無創(chuàng)性生化標(biāo)志物用于臨床腎移植排斥反應(yīng)的早期判定，而正常組患者、穩(wěn)定組患者和免疫抑制劑中毒患者IL-17 在基因及蛋白質(zhì)水平含量相比差異無顯著性，可能由于腎移植術(shù)后患者在不出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)時，機(jī)體處于相對穩(wěn)態(tài)，各種細(xì)胞亞群功能也處于平衡，因此，IL-17檢測在鑒別急性排斥反應(yīng)時可能作為一種有效的診斷標(biāo)志物。

IL-17作為促炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，具有強(qiáng)大的促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子釋放及募集中性粒細(xì)胞的作用，IL-17與其受體結(jié)合后引起靶細(xì)胞表達(dá)和釋放趨化因子、集落刺激因子和黏附分子，招募和激活中性粒細(xì)胞從而介導(dǎo)炎癥影響免疫損傷的病理過程[10-12]。我們通過對移植腎穿刺活檢組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示IL-17在急性T細(xì)胞介導(dǎo)排斥、急性抗體介導(dǎo)排斥、交界性排斥和未見異常組的移植腎穿刺活檢組織中均有不同程度表達(dá)，但I(xiàn)L-17陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)中浸潤的炎細(xì)胞中，亦見于浸潤于腎小球的炎細(xì)胞，可能是IL-17參與移植腎急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。

在急性T細(xì)胞排斥反應(yīng)腎活檢組織中，IL-17高表達(dá)主要位于腎小管上皮及間質(zhì)炎細(xì)胞中，陽性表達(dá)率分別為84.4%(27/32)和81.3%(26/32)。在急性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中，IL-17在腎小管和腎間質(zhì)中陽性表達(dá)率分別為55.6%(5/9)和66.7%(6/9)，與未見明顯異常組腎小管(46.2%)和腎間質(zhì)(30.8%)比較，雖比值增高但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。急性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中IL-17表達(dá)與C4d沉積有關(guān)，這一結(jié)果提示，IL-17和C4d在急性抗體排斥反應(yīng)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并預(yù)示預(yù)后不良。在移植腎臨界改變組與未見明顯異常組的腎小管中有表達(dá)，其陽性表達(dá)率分別為61.6%(11/18)和46.2%(6/13)。這部分患者盡管此時無明顯的移植腎排斥反應(yīng)的典型病理改變，但是移植物中已出現(xiàn)IL-17陽性表達(dá)，尤其是腎小管中表達(dá)的IL-17值得重視。對臨界改變組和未見異常組隨訪中我們發(fā)現(xiàn)，2例腎穿病理曾經(jīng)診斷為未見異常組的患者分別于110 d、320 d后發(fā)生移植腎臨界改變，而另1例曾經(jīng)病理診斷為未見異常組的患者20 d后發(fā)生慢性活動性T細(xì)胞介導(dǎo)排異反應(yīng)，這也提示我們，有IL-17表達(dá)的移植腎組織，其再次發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險增高，提示IL-17可能是移植物預(yù)后不良的危險指標(biāo)[13]。

綜上所述，IL-17可作為監(jiān)測移植腎功能狀態(tài)以及預(yù)后判斷的重要組織學(xué)指標(biāo)，同時，由于移植物IL-17的出現(xiàn)與同種異體免疫反應(yīng)有關(guān)，這為預(yù)防及治療急性排斥反應(yīng)提供了新思路。