韓耀倫 王 璐 馬 欣

(河南省人民醫(yī)院口腔科,鄭州 450000)

牙髓炎是常見的口腔疾病，如果不能得到積極的治療可引起牙根尖周組織炎癥、咀嚼障礙、牙列缺損等；牙髓炎最重要的致病因素為微生物感染，脂多糖是牙髓炎的主要毒力因子，容易引起牙髓組織的炎癥反應(yīng)，因此降解脂多糖、抑菌等消除感染因素在治療牙髓炎中具有重要意義[1，2]。蓋髓劑在牙髓的保存治療中發(fā)揮重要作用，目前使用的蓋髓劑不能降解脂多糖等毒性產(chǎn)物、不能抗炎抑菌，因此不能從根本上保護(hù)牙髓細(xì)胞。黃芩苷具有抗炎、抑菌、降解脂多糖等作用[3，4]，研究發(fā)現(xiàn)用黃芩苷糊劑蓋髓治療犬實驗性牙髓炎的效果優(yōu)于Dycal的蓋髓效果[5]。但黃芩苷抑制牙髓炎癥的機(jī)制尚不十分清楚，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路在多種疾病中發(fā)揮作用[6]。本文通過對黃芩苷對大鼠牙髓細(xì)胞的保護(hù)作用及對TLR4/NF-κB信號通路的影響進(jìn)行研究，探討黃芩苷是否通過TLR4/NF-κB通路抑制牙髓炎的炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮保護(hù)牙髓細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康、清潔級、8周齡、雌雄各半、體重240～290 g、SD大鼠36只購自中國科學(xué)院微生物研究所，許可證號：SYXK(京)2014-0032。

1.1.2主要試劑和儀器 黃芩苷(中國藥品生物制品鑒定所)，玻璃離子液劑和粉劑(美國3M公司)，RIPA裂解液、氯仿、異丙醇、BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Sigma公司)，RT-PCR試劑盒、ELISA試劑盒(美國Invitrogen公司)，TLR4抗體、NF-κB抗體(美國Abcam公司)，高速離心機(jī)(日本NSK公司)，7500熒光定量PCR儀(美國LIGHT ABI公司)。

1.1.3黃芩苷糊劑[5]將黃芩苷和生理鹽水調(diào)和成稠糊狀。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 將36只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、牙髓炎組和黃芩苷組，每組12只。每只大鼠選擇左上頜和右上頜第一、第二磨牙進(jìn)行實驗，每組共48只實驗牙。

1.2.2大鼠模型建立及處理[7]將36只大鼠麻醉成功后仰臥固定，乙醇消毒實驗牙，在噴水冷卻下鉆磨實驗牙中央窩，鉆至深層牙本質(zhì)近髓透紅，用擴(kuò)孔銼捅開牙髓腔，用探針將開髓孔擴(kuò)大至直徑0.5 mm，無菌生理鹽水沖洗，棉球止血、擦干。將含1 μl大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)脂多糖(濃度5 g/L)的棉捻放置開髓孔處30 min，然后用生理鹽水沖洗、擦干，黃芩苷組放置黃芩苷糊劑蓋髓，牙髓炎組不放蓋髓材料，然后用玻璃離子水門汀封洞。對照組大鼠不做任何干預(yù)。

1.2.3標(biāo)本采集 術(shù)后7 d，全麻成功后脫頸處死大鼠，獲取大鼠上頜骨和牙齒標(biāo)本，每只大鼠取1只實驗牙用于牙髓組織HE染色，1只實驗牙用于牙髓組織中TNF-α、IL-6含量測定，1只實驗牙用于牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平測定，1只實驗牙用于牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平測定。

1.2.4牙髓組織HE染色 將大鼠的上頜骨及牙齒標(biāo)本用甲醛固定48 h，乙二胺四乙酸二鈉脫鈣1個月，酒精梯度脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察牙髓染色情況。并對牙髓炎組和黃芩苷組的牙髓組織進(jìn)行病理學(xué)評價[8]，組織紊亂程度分為0～3級：正常組織為0級，中心牙髓組織正常、成牙本質(zhì)細(xì)胞層紊亂為1級，全部牙髓組織失去正常形態(tài)為2級，牙髓壞死為3級。細(xì)胞炎癥反應(yīng)分為0～3級：開髓孔對應(yīng)牙髓組織中僅有個別或無炎癥細(xì)胞為0級，輕度炎癥細(xì)胞浸潤為1級，中度炎癥細(xì)胞浸潤為2級，重度炎癥細(xì)胞浸潤或形成膿腫為3級。硬組織形成分0～3級：無硬組織形成為0級，穿髓孔下少量硬組織形成為1級，穿髓孔下中等量硬組織形成為2級，穿髓孔下大量硬組織形成為3級。

1.2.5牙髓組織中TNF-α、IL-6含量測定 收集大鼠牙髓組織標(biāo)本，采用ELISA法測定牙髓組織中TNF-α、IL-6含量：在常溫下將凍干標(biāo)準(zhǔn)品瓶中加入離子水將TNF-α、IL-6濃度調(diào)為250 pg/ml，靜置15 min，把TNF-α、IL-6全部溶解，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍比梯度稀釋溶液依次加入檢測孔中(標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度從 0～250 pg/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線取7個點)。計算一次實驗需要的板條數(shù)，將全部板條取出放在框架內(nèi)，將標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔孵育120 min，加入洗滌液洗板5次，加入生物素化抗體工作液孵育60 min，洗板5次，加入酶結(jié)合物工作液孵育20 min，洗板5次，加入顯色劑TMB孵育20 min，加入終止液，使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度吸光度值為坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品TNF-α、IL-6濃度。

1.2.6牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平測定 小心剝離大鼠磨牙，取出牙髓組織標(biāo)本，用勻漿器進(jìn)行研磨，加入Trizol提取牙髓組織總RNA，將牙髓RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR測定牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平，PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 30 s，共38個循環(huán)，72℃ 1 min。以2-ΔΔCt表示牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平。TLR4引物序列：上游引物：5′-GGCATGATGTTGATTCTCGTTG-3′，下游引物：5′-AGCATTCTGGTCCGACTGC-3′。NF-κB引物序列：上游引物：5′-CTGAAGGACCGCGATACGTCT-3′，下游引物：5′-GAGAAGTGGATCTGCCGAAT-3′。

1.2.7牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平測定 小心剝離大鼠磨牙，取出牙髓組織標(biāo)本，用勻漿器進(jìn)行研磨，加入RIPA裂解液提取牙髓組織總蛋白，用BCA法測定牙髓總蛋白濃度，采用Western blot法測定牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平。進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(TLR4抗體為1∶100，NF-κB抗體為1∶100)，過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗，孵育1 h。用Odyssey成像儀成像，以Image J分析蛋白的灰度值。TLR4和NF-κB蛋白水平以TLR4和NF-κB蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠牙髓組織HE染色 對照組大鼠牙髓組織正常：成牙本質(zhì)層細(xì)胞排列整齊，無血管擴(kuò)張充血，無明顯中性多核細(xì)胞浸潤。牙髓炎組大鼠牙髓組織中成牙本質(zhì)細(xì)胞排列明顯紊亂，血管擴(kuò)張充血明顯，見大量中性多核白細(xì)胞浸潤，表明牙髓炎模型建立成功。黃芩苷組大鼠牙髓組織中成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂、血管擴(kuò)張充血、中性多核白細(xì)胞浸潤程度均較牙髓炎組輕，介于牙髓炎組和對照組之間。見圖1。

2.2牙髓炎組和黃芩苷組大鼠牙髓組織病理學(xué)評價指標(biāo)比較 黃芩苷組大鼠牙髓組織紊亂分級和細(xì)胞炎癥反應(yīng)分級均低于牙髓炎組(P<0.05)，硬組織形成分級與牙髓炎組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 牙髓炎組和黃芩苷組大鼠牙髓組織病理學(xué)評價指標(biāo)比較

Tab.1 Comparison of pathological evaluation indexes of pulp tissue in rats in pulpitis group and baicalin group

GroupsnTissue disorderclassification (grade)Cytoinflammatory responseclassification (grade)Hard tissue formationclassification (grade)Pulpitis group122.13±0.542.46±0.470.97±0.31Baicalin group121.24±0.431.08±0.360.89±0.28t4.4668.0750.663P0.0000.0000.514

2.3三組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量比較 與對照組比較，牙髓炎組和黃芩苷組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05)，與牙髓炎組比較，黃芩苷組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量比較

Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)Control group124.87±2.135.41±2.24Pulpitis group1234.52±2.641)29.85±2.731)Baicalin group1215.36±2.431)2)13.97±2.511)2)F467.372294.960P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

2.4三組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平比較 與對照組比較，牙髓炎組和黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平升高(P<0.05)，與牙髓炎組比較，黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平降低(P<0.05)。見表3。

圖1 三組大鼠牙髓組織HE染色(×100)Fig.1 HE staining of rat dental pulp tissue of three groups (×100)

表3 三組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平比較

Tab.3 Comparison of TLR4 and NF-κB mRNA levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTLR4 mRNANF-κB mRNAControl group121.00±0.091.00±0.08Pulpitis group123.14±0.131)3.42±0.141)Baicalin group122.23±0.121)2)2.53±0.111)2)F1 053.8981 415.654P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

表4 三組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平比較

Tab.4 Comparison of TLR4 and NF-κB protein levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTLR4 proteinNF-κB proteinControl group120.17±0.080.14±0.09Pulpitis group120.39±0.131)0.93±0.161)Baicalin group120.26±0.111)2)0.47±0.141)2)F12.441106.334P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

圖2 三組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot analysis of TLR4 and NF-κB proteins in pulp tissue of three groupsNote:A.Control group；B.Pulpitis group；C.Baicalin group.

2.5三組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平比較 與對照組比較，牙髓炎組和黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)，與牙髓炎組比較，黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)。見表4、圖2。

3 討論

牙髓炎的主要病因是病原微生物感染，厭氧菌是牙髓炎的優(yōu)勢菌，以革蘭陰性菌最多；細(xì)菌進(jìn)入牙髓后可產(chǎn)生多種有害物質(zhì)，產(chǎn)生的有害物質(zhì)可直接損傷組織細(xì)胞，或通過免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等間接損傷組織。感染牙髓的厭氧菌的內(nèi)毒素、菌體表面物質(zhì)、各種毒性酶等均為致病物質(zhì)，其中革蘭陰性菌細(xì)胞壁產(chǎn)物-內(nèi)毒素是比較重要的毒性產(chǎn)物，內(nèi)毒素的主要毒性成分為脂多糖中的類脂A，脂多糖是引起細(xì)胞損傷的主要毒力因子[9]。脂多糖對牙髓的損傷表現(xiàn)在：脂多糖為低分子物質(zhì)，具有比較強(qiáng)的滲透性，因此更容易通過牙本質(zhì)小管、牙根尖孔以及牙側(cè)支根管等，刺激牙髓組織，使牙髓組織處于炎癥狀態(tài)[10]；脂多糖對牙髓成纖維細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可引起牙髓的免疫、炎癥反應(yīng)；脂多糖是一種強(qiáng)烈的致炎因子，在炎癥牙髓中聚集了大量樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，上述細(xì)胞作為脂多糖的靶細(xì)胞，將脂多糖的炎癥信號通過TLR4等傳遞到細(xì)胞內(nèi)[11,12]，刺激NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核中，激活TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2等基因表達(dá)，從而啟動炎癥反應(yīng)[13-15]。本研究通過對大鼠磨牙開髓并在開髓孔處放置脂多糖建立牙髓炎模型，發(fā)現(xiàn)牙髓炎模型大鼠牙髓組織出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)，牙髓組織中TNF-α、IL-6含量升高，TLR4和NF-κB mRNA和蛋白水平也升高，表明脂多糖建立牙髓炎模型成功，脂多糖刺激牙髓中的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞，將脂多糖的炎癥信號通過TLR4等傳遞到細(xì)胞內(nèi)，刺激NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核中，從而激活TNF-α、IL-6等下游炎癥細(xì)胞因子，啟動炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙髓炎的發(fā)生。

黃芩的干燥根是藥用部分，黃酮類化合物為其主要成分，包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黃芩新素等[16,17]，其中黃芩苷是藥理作用最強(qiáng)的有效成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)[8-20]。黃芩苷可通過多種信號通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，在抑制炎癥反應(yīng)中，可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用，如歐陽龍強(qiáng)等[21]研究發(fā)現(xiàn)小鼠癲癇發(fā)作后可激活TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路引起海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，黃芩苷可通過抑制信號通路及其下游炎癥細(xì)胞因子水平，發(fā)揮對癲癇小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用；李敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制CCL4誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而改善肝纖維化。本研究對牙髓炎大鼠采用黃芩苷糊劑蓋髓，發(fā)現(xiàn)與牙髓炎組比較，黃芩苷組大鼠牙髓組織炎癥反應(yīng)級別和組織紊亂程度均降低，TNF-α、IL-6含量降低，TLR4和NF-κB mRNA和蛋白水平也降低。表明黃芩苷對牙髓炎具有抑制作用，其機(jī)制可能為黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制脂多糖炎癥信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，從而抑制其下游TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的激活，通過抑制炎癥反應(yīng)的啟動發(fā)揮對牙髓炎的抑制作用，保護(hù)牙髓細(xì)胞。

綜上所述，黃芩苷具有抑制牙髓炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能為黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB信號通路及其下游炎癥細(xì)胞因子的激活從而抑制牙髓炎的炎癥反應(yīng)。