王根生 盧錫華 李廷坤 楊青存

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，鄭州 450003)

麻醉藥物損傷嬰幼兒學(xué)習(xí)記憶功能一直是大眾關(guān)注的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，全麻后可能2歲以下嬰幼兒造成較長(zhǎng)時(shí)間的人格及行為變化，這說明全麻藥能給嬰幼兒中樞神經(jīng)帶來損害[1]。丙泊酚的特點(diǎn)是術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低、起效快、恢復(fù)快、作用時(shí)間短，作為一種新型的全身麻醉藥被廣泛運(yùn)用于麻醉的誘導(dǎo)、維持及鎮(zhèn)靜。但是，目前仍未清楚丙泊酚對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制。

在腦部發(fā)育中小腦能夠調(diào)控其他區(qū)域功能形成，兩者間有著復(fù)雜的聯(lián)系。許多研究指出，小腦參與情感、認(rèn)知等高級(jí)功能[2,3]，而發(fā)生功能障礙時(shí)可能導(dǎo)致自閉癥、朱比特綜合征、唐氏綜合征及其他精神疾病產(chǎn)生[4]。長(zhǎng)期以來，研究報(bào)道指出丙泊酚可能引起運(yùn)動(dòng)障礙[5]，這說明丙泊酚能作用于小腦并造成損傷。還有報(bào)道指出丙泊酚對(duì)小腦組織中重要細(xì)胞-蒲肯野細(xì)胞活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用[6]，同時(shí)對(duì)小腦神經(jīng)環(huán)路也造成影響[7,8]。本研究采用Western blot和免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)丙泊酚對(duì)新生小鼠小腦神經(jīng)損傷情況，探討其對(duì)小腦神經(jīng)損傷作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 HE染色劑(北京中杉公司)；熒光二抗、生物素化二抗(Invitrogen 公司)；丙泊酚(AstraZenenca 公司，批號(hào):KV697);BCA試劑盒劑(碧云天公司)；SABC 試劑盒(Vector 公司)；Jagged1、Notch1抗體(BD公司)；10%脂肪乳(安徽豐原藥業(yè)股份有限公司);DAB 顯色試劑盒(北京中杉公司)。

1.1.2儀器 超低溫冰箱(Thermo scientific)；低溫高速離心機(jī)(Thermo公司)；冰凍切片機(jī)(Leica CM1950 型)；蛋白電泳儀(Bio-Rad)；照相儀器(ZEISS AX10 型)；Western曝光儀(Bio-Rad)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康臨產(chǎn)孕鼠(體質(zhì)量24～32 g)由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，4月齡。維持動(dòng)物房22～26℃飼養(yǎng)，自然采光，保證飲水及食物。小鼠剛出生時(shí)記為P0，每24 h依次記為P1、P2等。P7 時(shí)，隨機(jī)將新出生小鼠分為三組：對(duì)照組(Control group)、30 mg/kg丙泊酚組(Pro 30 mg/kg group)、60 mg/kg丙泊酚組(Pro 60 mg/kg group)[9]，每組各5只。

1.2.2模型建立 P7 時(shí)，對(duì)照組、低劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組分別腹腔注射10%脂肪乳溶劑、丙泊酚30 mg/kg、60 mg/kg。24 h后處死小鼠，收取標(biāo)本作熒光免疫組化(圖片分析均選擇小腦葉片相同區(qū)域)及Western blot試驗(yàn)。

1.2.3HE染色 將取出的小腦組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，包埋，連續(xù)切片，厚度約3 μm，行 HE 染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.4免疫組織化學(xué)熒光染色 小鼠處死后，取腦標(biāo)本置于 4%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，置于修復(fù)液中微波加熱修復(fù)，H2O2封閉，PBS 漂洗后 0.3% Triton 37℃ 處理30 min，3%胎牛血清(BSA)封閉反應(yīng)30 min，滴加適量稀釋的大鼠CB、BLBP、GFAP抗體，4℃孵育過夜，PBS 沖洗8 min×3次，將標(biāo)本置于免疫熒光二抗中，37℃孵育2 h，PBS 漂洗8 min×3次，DAPI 進(jìn)行復(fù)染，再次 PBS 漂洗后漂片，晾干，熒光封片劑封片。

1.2.5Western blot檢測(cè) 小鼠處死后，迅速取小腦新鮮組織，采用RIPA 裂解法提取總蛋白，并用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)至一致。將蛋白樣品和加樣緩沖液混合煮沸變性，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳條件：濃縮膠恒壓60 V 約 30 min，分離膠120 V 約90 min。轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，2.5%脫脂奶粉封閉2 h，加適量一抗Jagged1、Notch1在4℃孵育過夜后，加入二抗室溫振蕩孵育2 h，經(jīng)ECL顯色后膠片曝光顯影，并用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。用 Quantity One軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)定其吸光度(A)值。以A目的蛋白/AGAPDH表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1小腦HE染色 選取新生小鼠小腦葉片同一部位顯微觀察，對(duì)照組、30 mg/kg丙泊酚組、60 mg/kg丙泊酚組間外顆粒層(EGL)厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，n=5)，見圖1。

2.2免疫熒光檢測(cè) 與對(duì)照組相比，低劑量丙泊酚組蒲肯野細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量丙泊酚組蒲肯野細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照明顯減少(P<0.05，n=5)，見圖2。

2.3BLBP、GFAP熒光染色結(jié)果 與對(duì)照組相比，低劑量及高劑量丙泊酚組BLBP陽性纖維數(shù)量減少(P<0.05，n=5)；與對(duì)照組相比，低劑量組GFAP陽性纖維數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量丙泊酚組GFAP陽性纖維數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(P<0.05，n=5)；與對(duì)照組相比，丙泊酚高劑量小腦內(nèi)顆粒層及深部白質(zhì)區(qū)域GFAP陽性纖維光密度值明顯上升(P<0.05，n=5)，這說明有星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，見圖3。

2.4Western blot檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，丙泊酚低劑量組中Jagged1、Notch蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01,P<0.05)，并且丙泊酚高劑量組中Jagged1、Notch蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組進(jìn)一步降低(P<0.01,P<0.01)。丙泊酚低劑量和高劑量組中Jagged1蛋白較對(duì)照組分別下調(diào)23%和32%，而Notch蛋白則分別下調(diào)25%和37%，見圖4。

圖1 新生小鼠小腦HE染色結(jié)果(×400)

Fig.1 HE staining of cerebellum in neonatal mice(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Comparison of outer granule thickness among three groups.

圖2 新生小鼠小腦浦肯野細(xì)胞染色(×400)

Fig.2 Purkinje cell staining of cerebellum in neonatal mice(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Number of Purkinje cells,*.P<0.05 vs Control.

3 討論

丙泊酚是目前臨床上的新型麻醉藥，具有起效快、功能恢復(fù)快且蘇醒迅速的特點(diǎn)，主要用于麻醉誘導(dǎo)、維持及 ICU 鎮(zhèn)靜。研究報(bào)道10 min內(nèi)丙泊酚對(duì)嬰幼兒劑量分別為25 mg/(kg·h)(<3月)，20 mg/(kg·h)(3～6月)，15 mg/(kg·h)(6～12月)，12 mg/(kg·h)(1～3歲)。研究還發(fā)現(xiàn)，新生兒時(shí)期如接觸麻醉制劑，則可能導(dǎo)致新生兒長(zhǎng)期認(rèn)知改變及大腦受損[10，11]，同時(shí)有臨床研究報(bào)道，新生兒時(shí)期麻醉會(huì)影響兒童后期學(xué)習(xí)能力[12]，并且可能是造成行為障礙及腦發(fā)育損傷的高危因素[13]。小腦皮層是由顆粒細(xì)胞層、浦肯野細(xì)胞層及分子層構(gòu)成，主要包括高爾基細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞等，其中顆粒細(xì)胞是以谷氨酸為遞質(zhì)的興奮性神經(jīng)元，其余高爾基細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞等均是以 GABA 作為遞質(zhì)的抑制性神經(jīng)元。蒲肯野細(xì)胞位于小腦蒲肯野細(xì)胞層，是特殊的大細(xì)胞神經(jīng)元。出生后2周內(nèi)，是蒲肯野細(xì)胞發(fā)育的主要時(shí)期，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變形成多分支狀樹突生長(zhǎng)[14]。在小腦環(huán)路中，經(jīng)蒲肯野細(xì)胞整合后發(fā)出的信息參與動(dòng)作學(xué)習(xí)和動(dòng)作協(xié)調(diào)，屬于唯一的傳出神經(jīng)元[15，16]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，新生期注射丙泊酚會(huì)導(dǎo)致出生后典型板層結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以及海馬區(qū)細(xì)胞丟失[17]。本實(shí)驗(yàn)表明，丙泊酚注射后會(huì)明顯抑制新生小鼠小腦蒲肯野細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，且抑制程度與劑量相關(guān)，這說明小腦可能是丙泊酚的作用靶點(diǎn)，且丙泊酚具有神經(jīng)毒性作用;伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞(Bergman glial cell)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，在小腦皮質(zhì)發(fā)育過程中會(huì)發(fā)出放射狀纖維至外顆粒層表面，這種放射狀細(xì)胞又會(huì)分化形成伯格曼細(xì)胞[18]。作為Bergman膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，GFAP可以同時(shí)標(biāo)記放膠樣及星膠樣Bergman細(xì)胞，而BLBP可以標(biāo)記放射狀膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙泊酚麻醉小鼠后，Pro 30 mg/kg組及Pro 60 mg/kg組BLBP陽性纖維數(shù)量均較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)；GFAP染色觀察結(jié)果顯示，Pro 30 mg/kg組中GFAP陽性纖維數(shù)量較對(duì)照組無明顯差異，而Pro 60 mg/kg處理后，GFAP膠質(zhì)纖維數(shù)量較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。同時(shí)，Pro 60 mg/kg組內(nèi)顆粒層和白質(zhì)中BFAP陽性染色光密度值較對(duì)照組明顯上升(P<0.05)，這說明丙泊酚可能促進(jìn)了放膠樣到星膠樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而對(duì)伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞造成影響。

圖3 BLBP、GFAP熒光染色(×400)

Fig.3 Fluorescence staining results of BLBP and GFAP(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D,E and F represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;G.GFAP positive fiber number (scale length 100 μm);H.BLBP positive fiber number (scale length 100 μm);I.GFAP positive staining light density value,*.P<0.05 vs Control group；#.P<0.05 vs Control group.

圖4 Western blot檢測(cè)新生小鼠小腦中Jagged1、Notch 蛋白表達(dá)Fig.4 Detection of Jagged1 and Notch protein expression in cerebellum of neonatal mice by Western blotNote:A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Relative expression level of Jagged1 and Notch protein,*.P<0.01 vs Control group；#.P<0.05 vs Control group.

研究報(bào)道，Notch 信號(hào)通路是Bergman膠質(zhì)細(xì)胞分化、成熟的相關(guān)重要信號(hào)通路之一。研究發(fā)現(xiàn)，出生后2周內(nèi)小腦在發(fā)育過程中Bergman膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)Notch及其配體 Jagged 蛋白表達(dá)[19]。此外，小腦中Notch信號(hào)通路被激活后還能促進(jìn)星形細(xì)胞向放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[20]。許多研究表明，小鼠敲除Notch或者Jagged基因后，小腦中伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞不僅數(shù)量減少并且發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致蒲肯野細(xì)胞發(fā)育障礙以及顆粒神經(jīng)元遷移受阻[21]。本研究中Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在丙泊酚低劑量、高劑量處理后Notch 及 Jagged 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示Notch 信號(hào)通路異常與Bergman膠質(zhì)細(xì)胞的損傷、表型失衡和轉(zhuǎn)化相關(guān)，而這也可能是丙泊酚引起小腦發(fā)育異常的源頭。

綜上所述，丙泊酚麻醉可明顯抑制浦肯野細(xì)胞數(shù)量、Bergman膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育及纖維形成，同時(shí)對(duì)小腦中Jagged1、Notch 蛋白表達(dá)也產(chǎn)生抑制作用。通過本實(shí)驗(yàn)可以看出，小腦作為參與高級(jí)認(rèn)知功能并與大腦有復(fù)雜聯(lián)系的神經(jīng)組織易受到丙泊酚的神經(jīng)毒性作用，提示應(yīng)用丙泊酚要注意對(duì)新生兒小腦的影響，也為其治療提供新的思路及研究方向。