余孟珠 李 莉 薛 菲 單文琪 呂劍平 汪雪峰
(江蘇大學附屬醫(yī)院兒科,鎮(zhèn)江 212001)
支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,嚴重危害兒童身心健康。其發(fā)病機制尚不十分清楚,但細胞因子在該炎癥中所起的重要作用已受到國內(nèi)外學者越來越多關(guān)注。髓樣抑制細胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)是20世紀80年代在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一群異質(zhì)性細胞群,源自骨髓祖細胞及未成熟髓細胞,具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能[1,2]。MDSCs分兩個亞群,一類為單核細胞樣MDSC(M-MDSC),表達CD11b+Ly6G-Ly6Chigh表型,另一類為粒細胞樣MDSC(G-MDSC),表達CD11b+Ly6G+Ly6Clow表型[3]。隨著深入研究,MDSCs不僅在腫瘤發(fā)展中扮演重要角色,而且在病毒感染、敗血癥及自身免疫系統(tǒng)疾病中也起著重要作用[4]。國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn),MDSCs在肺部過敏性炎癥中也有高表達,同時參與哮喘肺部炎癥、氣道高反應及氣道重塑發(fā)生發(fā)展[5,6]。研究表明,MDSCs可通過表達高水平的免疫抑制因子發(fā)揮免疫作用,如:精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)和誘導性一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOs)等[7]。目前,MDSCs在哮喘病情進展中發(fā)揮作用的機理尚不明確。本文通過分析哮喘小鼠脾細胞中MDSCs兩個亞群所占有核細胞比例,以及MDSCs產(chǎn)物Arg-1、iNOs在小鼠中表達水平,初步探討MDSCs在哮喘發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。
1.1材料
1.1.1研究對象 選擇6~8周齡雄性BALB/c小鼠,揚州大學動物研究中心購買[動物合格證號:SCXK(蘇)2017-0007],實驗中所用小鼠隨機分為對照組(control)和哮喘組(OVA)進行造模,每組20只,所有小鼠均在江蘇大學實驗動物中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。
1.1.2主要試劑 卵清蛋白(OVA,V級)購自美國Sigma公司;goat anti-mouse IgE購自美國Abcam公司;HRP-conjugated rabbit anti-goat secondary IgE購自中國Multisciences公司;FITC anti-mouse CD11b、PE anti-mouse Ly-6C、APC anti-mouse Ly6G購自美國Biolegend公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司;熒光定量PCR試劑盒All-in-oneTMMix購自美國Genecopoeia公司;NOS2 Polycional Antibody、ARG1 Polycional Antibody、GAPDH Polycional Antibody、HRP Goat Anti-Rabbit IgG購自美國ABclonal公司。
1.2方法
1.2.1哮喘模型建立 分別于第1、8和15天,哮喘組小鼠給予腹腔內(nèi)注射抗原混合溶液 0.2 ml(含OVA 50 μg、10%氫氧化鋁),對照組給予腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS)0.2 ml。第22天開始,哮喘組小鼠每日霧化吸入2% OVA進行哮喘激發(fā),每次30 min,每日1次,持續(xù)至第28天,共計7 d。對照組小鼠給予PBS霧化替代。
1.2.2支氣管肺泡灌洗液收集 結(jié)扎左主支氣管后,取預冷的PBS緩沖液1 ml,分3次緩慢沖洗右肺,收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF),裂解紅細胞后進行細胞計數(shù),計數(shù)完成后離心取細胞沉渣涂片,瑞氏染色后計數(shù)嗜酸細胞(Eosnophils,EOS)百分比。
1.2.3血清OVA特異性抗體IgE檢測 取小鼠眼球血約1 ml,室溫靜置30 min后,3 000 r/min,離心15 min取上層血清。采用ELISA法檢測血清OVA特異性抗體IgE水平,在450 nm處測吸光度(OD)值。
1.2.4肺組織病理評分 取小鼠左肺組織切片進行HE染色,光鏡下進行觀察。參考文獻[8]對病理組織切片進行炎癥評分。
1.2.5PBMC的提取及MDSCs細胞檢測 小鼠麻醉處死后,仰臥位固定,暴露腹腔取脾臟,加入Stanning buffer(含2%胎牛血清的PBS溶液)研磨成單個核細胞,將得到的脾細胞懸液離心棄上清,加入1 ml buffer重懸細胞后,每管加入12 ml紅細胞裂解液,靜置3 min,充分裂解紅細胞,離心棄上清,洗一遍后進行過濾,再次離心棄上清,用buffer洗一遍,重懸后計數(shù)。取每管106個細胞加入100 μl buffer混勻,分別加入FITC anti-mouse CD11b、PE anti-mouse Ly-6C及APC anti-mouse Ly6G,4℃避光染色30 min,加入buffer洗2遍,加入400 μl的buffer混勻,用流式細胞儀檢測。
1.2.6qRT-PCR檢測Arg-1、iNOs mRNA表達 提取脾細胞及肺組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,按照All-in-oneTMMix試劑盒說明書,分別進行實時熒光PCR檢測Arg-1、iNOs、GAPDH。用GAPDH對目的基因表達進行標準化。引物由美國Genecopoeia公司設(shè)計合成,貨號如下:Arg-1(No.MQP026580)、iNOs(No.MQP029793)、GAPDH(No.MQP027158)。
1.2.7Western blot法檢測Arg-1、iNOs蛋白表達 提取肺組織蛋白,定量后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉,將配置好的一抗(用1% BSA以1∶1 000稀釋)分別倒入孵育盒,將封閉后用TBST清洗后放入一抗中,4℃過夜,TBST洗滌3次,加入HRP標記的抗兔二抗(以1∶5 000稀釋),室溫孵育2 h,TBST洗滌5次,加入ECL發(fā)光液作用后曝光,最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行蛋白條帶的半定量分析。
1.3統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析,以非配對t檢驗分析兩組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1兩組小鼠BALF細胞計數(shù)和EOS百分比結(jié)果比較 結(jié)果如圖1所示,哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比顯著高于對照組(P均<0.05)。
圖1 BALF細胞計數(shù)和EOS百分比Fig.1 Number of total cells and proportion of eosinophils in BALFNote:
2.2兩組小鼠血清OVA特異性抗體IgE水平結(jié)果比較 如圖2所示,與對照組相比,哮喘組小鼠血清OVA特異性抗體IgE表達水平明顯增高(P<0.05)。
圖2 血清OVA特異性抗體IgE水平Fig.2 Level of Anti-OVA-specific IgE in serum of miceNote:
2.3兩組小鼠肺組織病理結(jié)果比較 與對照組相比,哮喘組小鼠肺組織支氣管管壁增厚,管腔狹窄,肺泡間隔增厚,支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤明顯。炎癥評分較對照組明顯增高(P<0.05),見圖3。
圖3 肺組織病理切片結(jié)果Fig.3 Pathological section of lung tissue and inflamma-tion scoreNote:
2.4兩組小鼠脾細胞中MDSCs兩個亞群占有核細胞比例 流式細胞術(shù)檢測兩組小鼠脾細胞中MDSCs兩個亞群占有核細胞比例,如圖4所示,哮喘組小鼠脾細胞中G-MDSC亞群細胞所占比例明顯高于對照組(P<0.001),而兩組間M-MDSC亞群無明顯差別(P>0.05)。
圖4 流式細胞術(shù)檢測脾細胞中MDSCs細胞比例Fig.4 Percentage of MDSCs were analyzed by flow cytometryNote:
2.5兩組小鼠脾細胞中Arg-1、iNOs mRNA表達水平 采用qRT-PCR檢測Arg-1、iNOs mRNA的表達,結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,哮喘組小鼠脾細胞中Arg-1 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.01);iNOs mRNA的表達明顯降低(P<0.001)。
圖5 小鼠脾細胞中Arg-1、iNOs mRNA的表達Fig.5 Expression of Arg-1 and iNOs mRNA in spleen of mice Note:
2.6兩組小鼠肺組織中Arg-1、iNOs mRNA表達 采用qRT-PCR檢測小鼠肺組織中Arg-1、iNOs mRNA的表達,結(jié)果如圖6所示,與對照組相比,哮喘組小鼠肺組織中Arg-1 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.001),iNOs mRNA的表達明顯降低(P<0.001)。
圖6 小鼠肺組織中Arg-1、iNOs mRNA的表達 Fig.6 Expression of Arg-1 and iNOs mRNA in lung of miceNote:
圖7 小鼠肺組織中Arg-1、iNOs蛋白表達水平Fig.7 Protein expression of Arg-1 and iNOs in lung of miceNote:
2.7兩組小鼠肺組織中Arg-1、iNOs蛋白表達 采用Western blot法檢測小鼠肺組織中Arg-1、iNOs蛋白水平的表達,結(jié)果如圖7所示,與對照組相比,哮喘組小鼠肺組織中Arg-1蛋白水平表達水平明顯升高(P<0.001),iNOs蛋白的表達明顯降低(P<0.001)。
支氣管哮喘是全世界范圍內(nèi)兒童最常見的慢性下呼吸道疾病。本研究中,哮喘組小鼠經(jīng)OVA致敏及霧化激發(fā)后,呈現(xiàn)出明顯的頭面部瘙癢、安靜少動、弓背、前肢抬起、大小便失禁等哮喘急性發(fā)作的表現(xiàn),其BALF中細胞總數(shù)、EOS百分比及血清OVA特異性抗體IgE表達水平與對照組相比明顯增高,肺組織病理切片HE染色顯示,支氣管管壁增厚,管腔狹窄,腔內(nèi)可見大量的黏液,支氣管及血管周圍可見大量炎性細胞浸潤,符合哮喘的病理改變,提示哮喘模型制備成功。
MDSCs是骨髓來源的一群異質(zhì)性細胞,不僅參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和增殖,而且在病毒感染、敗血癥、急慢性非特異性炎癥、哮喘、創(chuàng)傷以及其他自身免疫疾病中起重要作用。支氣管哮喘是一種以多種細胞浸潤和氣道高反應為特征的慢性氣道炎癥性疾病,目前已知與Th1/Th2、Th17/Treg失衡相關(guān)[9,10],但其具體發(fā)病機制尚未完全清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn),在反復喘息患兒外周血中MDSCs比例明顯升高于肺炎組及正常對照組[11],這與文獻報道MDSCs在哮喘患兒體內(nèi)表達升高是一致的[12],然而,哮喘發(fā)病過程中MDSCs具體作用機制尚不明確。
研究表明,MDSCs可產(chǎn)生高水平的免疫抑制因子Arg-1、iNOs和活性氧(ROS),而Arg-1和iNOs在抑制T細胞功能方面的作用已被證實[13]。Arg-1可將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L-鳥氨酸和尿素,iNOs可產(chǎn)生NO。MDSCs產(chǎn)生的Arg-1活性增加可導致L-精氨酸分解代謝增強,進而從微環(huán)境中消耗這種非必需氨基酸,而L-精氨酸與T細胞增殖調(diào)節(jié)密切相關(guān)。L-精氨酸缺乏抑制T細胞增殖可通過不同的途徑,包括減少T細胞受體(TCR)CD3ζ鏈的合成以及TCR信號通路轉(zhuǎn)導障礙等[7]。NO與O2-合成具有強氧化能力的過氧亞硝酸鹽(ONOO-),可導致TCR和CD8分子的硝化,從而誘導T細胞的凋亡。
本研究中兩組小鼠脾細胞中MDSCs細胞比例結(jié)果顯示,哮喘組G-MDSC與對照組相比明顯升高,M-MDSC亞群結(jié)果比較兩組間差異無統(tǒng)計學意義,推測MDSCs在哮喘發(fā)展中可能由G-MDSC亞群起主要作用。盡管大多文獻報道MDSCs高表達Arg-1、iNOs[14],但也有文獻報道MDSCs表達的Arg-1、iNOs存在差異,例如,王瑞等[15]發(fā)現(xiàn),與正常小鼠相比,在膠原誘導關(guān)節(jié)炎小鼠中MDSCs產(chǎn)物iNOs的表達升高,Arg-1的表達降低。而我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,哮喘組小鼠脾細胞及肺組織中Arg-1 mRNA表達均升高,iNOs mRNA表達均減少,且在小鼠肺組織中Arg-1及iNOs蛋白表達水平與此是一致的。由此推測,不同疾病狀態(tài)下機體微環(huán)境變化可能影響Arg-1和iNOs的表達,MDSCs可能通過高表達Arg-1參與哮喘小鼠氣道炎癥反應。也有研究表明,IL-4和IL-13可誘導產(chǎn)生Arg-1,IFN-γ可誘導產(chǎn)生iNOs[16]。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-12和TNF-β,Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等,哮喘狀態(tài)下存在Th1/Th2失衡,低表達的Th1細胞因子、高表達的Th2細胞因子是否誘導了Arg-1的高表達,抑制了iNOs的低表達,需要進一步實驗研究。
綜上所述,本研究結(jié)果顯示MDSCs尤其是G-MDSC亞群參與哮喘氣道炎癥反應,MDSCs可能通過高表達Arg-1、低表達iNOs參與哮喘小鼠氣道炎癥反應,需要進一步實驗明確MDSCs及其Arg-1、iNOs產(chǎn)物對哮喘發(fā)病過程中T細胞反應的影響,從而為以MDSCs為靶點的哮喘治療提供實驗依據(jù)。