韓 彬，龐文哲，高燕霞

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011）

頭孢美唑鈉是第2代頭孢菌素類(lèi)半合成抗菌藥物［1］，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的抗菌效能均良好，廣泛應(yīng)用于臨床［2-5］，對(duì)多種 β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，體內(nèi)分布好、不良反應(yīng)少［6］。研究表明，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物引發(fā)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)與藥物中存在的高分子聚合物雜質(zhì)有關(guān)［7-8］。頭孢美唑鈉聚合物測(cè)定方法收載于2015年版《中國(guó)藥典（二部）》［9］，采用分子排阻色譜法（Cef-SEC）對(duì)其高分子聚合物進(jìn)行測(cè)定，但實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果表明，葡聚糖凝膠G-10色譜柱的柱效較低，分離效果較差，峰形拖尾較嚴(yán)重，且測(cè)定分析時(shí)間較長(zhǎng)。本研究中建立了以WT-Cef-SEC為色譜柱的高效分子排阻色譜法測(cè)定頭孢美唑鈉中的聚合物，該法分離效能高、分析時(shí)間短、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，并通過(guò)在線(xiàn)脫鹽質(zhì)譜聯(lián)用法證明了其結(jié)果準(zhǔn)確可靠?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效分子排阻色譜（2D LC/LCMS-IT-TOF）系統(tǒng)，包括LC-20AD型輸液泵（4個(gè)），SIL-20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC型柱溫箱，CBM-20A型系統(tǒng)控制器，DGU-20A5型在線(xiàn)脫氣機(jī)，SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器（DAD），SPD-20A型紫外檢測(cè)器，F(xiàn)CV-12AH型流路選擇閥（3個(gè)），F(xiàn)CV-14AH型色譜柱切換閥（2個(gè)），離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LCMS-IT-TOF）儀和LC MS solution Ver.3.80色譜工作站（日本島津公司）。

1.2 試藥

注射用頭孢美唑鈉（河北某藥廠，批號(hào)分別為18101701，18101702，18101703，規(guī)格為按 GsH17N7O5S3計(jì)每次0.5 g）；頭孢美唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130580-201301，含量為86.9%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件

二維液相系統(tǒng)色譜條件：通路1，色譜柱為WT-Cef-SEC 柱（300 mm ×7.8 mm，5 μm），流動(dòng)相為5 mmol/L乙酸銨溶液 -乙腈（95 ∶5，V/V），流速為 0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。通路2，色譜柱為InertSustainTMC18柱（50 mm×2.1 mm，2 μm），流動(dòng)相為水 -乙腈（70 ∶30，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為 30℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），接口電壓4.5 kV，掃描范圍一級(jí)質(zhì)譜為m/z200～1500；自動(dòng)多級(jí)質(zhì)譜為m/z100～1 000；霧化氣為氮?dú)猓魉贋?1.5 L/min），干燥氣為氮?dú)猓魉贋?0 L/min），碰撞氣為氬氣，脫溶劑管及加熱模塊溫度均為200℃，檢測(cè)器電壓1.65 kV，校準(zhǔn)方法為自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)。

2.2 溶液配制

稱(chēng)取樣品50 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液（臨用新制）；另取頭孢美唑?qū)φ掌愤m量，精密稱(chēng)定，加水制成每1 mL中約含5 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下通路1液相色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖1。高效分子排阻色譜法檢測(cè)時(shí)，大分子量的化合物先出峰，因此，主峰前的峰為聚合物峰。其中聚合物1含量低于0.05%，聚合物2和聚合物3為頭孢美唑鈉主要高分子雜質(zhì)。

圖1 頭孢美唑鈉高效液相色譜圖

2.4 聚合物結(jié)構(gòu)鑒定

在2D-LC-IT-TOF/MS系統(tǒng)中，將頭孢美唑鈉主峰切換到LOOP環(huán)1中，經(jīng)通路2液相色譜條件進(jìn)樣分析，得MS色譜圖和多級(jí)質(zhì)譜圖，詳見(jiàn)圖2和圖3。頭孢美唑鈉相對(duì)分子質(zhì)量493.027 3，一級(jí)質(zhì)譜圖中［M+H］+為m/z494.032 9，與軟件計(jì)算理論值m/z494.034 6一致。

將聚合物3切換到LOOP環(huán)2中，經(jīng)通路2液相色譜條件進(jìn)樣分析，得MS色譜圖和多級(jí)質(zhì)譜圖，詳見(jiàn)圖4和圖 5。一級(jí)質(zhì)譜圖中［M+H］+為m/z987.705 2，是頭孢美唑鈉相對(duì)分子質(zhì)量的2倍，二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z495.825 6碎片為聚合位點(diǎn)的酰胺鍵斷裂形成的頭孢美唑鈉單體碎片。

將聚合物2切換到LOOP環(huán)3中，經(jīng)通路2液相色譜條件進(jìn)樣分析，得MS色譜圖和多級(jí)質(zhì)譜圖如圖6和圖 7。一級(jí)質(zhì)譜圖中［M+H］+為m/z1 480.138 7，是頭孢美唑鈉相對(duì)分子質(zhì)量的3倍。在二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z986.686 5碎片為聚合位點(diǎn)的酰胺鍵斷裂形成的頭孢美唑鈉二聚體碎片。

圖2 頭孢美唑鈉離子流圖

圖5 聚合物3多級(jí)質(zhì)譜圖

2.5方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：稱(chēng)取注射用頭孢美唑樣品50 mg，置10 mL容量瓶中，平行5份，分別進(jìn)行高溫（60℃下放置10 min）、酸破壞（0.1 mol/L HCl 1 mL，放置 1 min，取0.1 mol/L NaOH溶液1 mL中和）、堿破壞（0.1 mol/L NaOH 溶液 1 mL，放置 1 min，取 0.1 mol/L HCl溶液1 mL中和）、強(qiáng)光（3 500 lx強(qiáng)光照射 12 h）、氧化破壞（30%H2O21 mL，放置 1 min）加速破壞操作，按 2.1項(xiàng)下通路1液相色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。主峰與以上破壞產(chǎn)生的降解物峰均能獲得良好分離，不干擾聚合物的測(cè)定。

圖7 聚合物2二級(jí)質(zhì)譜圖

線(xiàn)性關(guān)系考察：取頭孢美唑?qū)φ掌愤m量，精密稱(chēng)定，用水溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的系列溶液，取 20 μL，按 2.1 項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程A=185.55C-13.213，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，頭孢美唑質(zhì)量濃度在0.5～20.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

定量限和檢測(cè)限檢測(cè)：取對(duì)照品溶液，加水倍比稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定。以信噪比（S/N）為10計(jì)，頭孢美唑的定量限為3 ng，以S/N為3計(jì)，頭孢美唑的檢測(cè)限為1 ng。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果的RSD為0.16%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為18101701）50 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，平行操作6份，按2.1項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果聚合物2和聚合物3平均含量分別為0.2%和0.1%，RSD分別為0.1%和0.3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.6 測(cè)定方法

因頭孢類(lèi)聚合物對(duì)照品不穩(wěn)定較難獲得［10-11］，但其聚合物為自身聚合而成，紫外吸收官能團(tuán)一致，在各種濃度下，聚合物峰與主峰的紫外吸收一致，故聚合物含量的測(cè)定均按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算。取3批樣品，分別按2.1項(xiàng)下通路1液相色譜條件及2015年版《中國(guó)藥典（二部）》收載的聚合物檢測(cè)方法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含頭孢美唑鈉聚合物以頭孢美唑計(jì)，規(guī)定限度為多聚物不得超過(guò)0.3%，二聚物不得超過(guò)0.5%。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）

3 討論

3.1 在線(xiàn)脫鹽液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

本試驗(yàn)中采用2D-LC-IT-TOF/MS法對(duì)注射用頭孢美唑鈉聚合物進(jìn)行鑒定［12］。該方法基于一組共用的餾分收集環(huán)的二維液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)建立，對(duì)目標(biāo)峰快速分析的同時(shí)可完成流動(dòng)相轉(zhuǎn)換即脫鹽過(guò)程，在不改變?cè)鲃?dòng)相條件的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了液質(zhì)聯(lián)用分析目標(biāo)雜質(zhì)，其中通路1液相色譜條件通過(guò)時(shí)間程序控制自動(dòng)對(duì)分離過(guò)程中的目標(biāo)雜質(zhì)進(jìn)行捕集；通路1液相色譜條件分析結(jié)束后，批處理自動(dòng)執(zhí)行通路2液相色譜條件分析，此時(shí)捕集在1個(gè)或多個(gè)餾分收集環(huán)中的雜質(zhì)組分分批依次通過(guò)適合質(zhì)譜分析的流動(dòng)相注入通路2液相色譜柱中，可在準(zhǔn)確推定檢出雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，又能實(shí)現(xiàn)對(duì)一維液相色譜條件下色譜圖中各雜質(zhì)的準(zhǔn)確定位。

3.2 色譜柱選擇

文獻(xiàn)資料鍵合球狀蛋白色譜用親水硅膠柱，聚合物峰與主峰之間的分離度有很大改善，但聚合物峰檢出數(shù)量少［13-14］。本研究中選擇的 WT-Cef-SEC色譜柱（Sepax公司）采用專(zhuān)利的表面修飾技術(shù)，獨(dú)有的化學(xué)修飾技術(shù)可精確控制親水涂層的厚度，聚合物峰與主峰之間的分離度有很大改善，同時(shí)具有更寬的耐用性和更強(qiáng)的分離效果，可更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，為企業(yè)改善生產(chǎn)工藝提供了技術(shù)支持。

3.3 聚合物峰分析

方法學(xué)考察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，樣品對(duì)酸堿極不穩(wěn)定，對(duì)高溫和氧化不穩(wěn)定，聚合物峰檢出數(shù)量明顯增多，提示產(chǎn)品結(jié)構(gòu)容易發(fā)生斷裂的位點(diǎn)較多［15］，高分子雜質(zhì)檢查有助于建立更適宜頭孢美唑鈉生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件。

3.4 與《中國(guó)藥典》方法對(duì)比

按2015年版《中國(guó)藥典（二部）》收載的注射用頭孢美唑鈉聚合物檢查方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，本方法的進(jìn)樣量更少，分析時(shí)間更短，靈敏度更高，分離度更好，檢出的聚合物更多，能快速、有效、高靈敏地檢出頭孢美唑鈉中的聚合物，同時(shí)為 β-內(nèi)酰胺類(lèi)其他抗菌藥物品種中聚合物的分離、分析及產(chǎn)品質(zhì)量提高提供了依據(jù)。