舒 婷，黃湘杰

（湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院藥劑科，湖南 湘潭 411400）

開胃健脾丸由白術(shù)、黨參、陳皮、茯苓、甘草、山楂等13味中藥材組方，有開胃健脾功效，臨床多用于治療脾胃不和、消化不良、食欲不振、噯氣吞酸等癥［1］。方中君藥白術(shù)的主要成分為白術(shù)內(nèi)酯類、揮發(fā)性成分、苷類及多糖類等［2-3］；臣藥黨參的有效成分為黨參炔苷［4-5］；2015年版《中國藥典（一部）》以黃酮類的橙皮苷為陳皮的指標成分［6-8］。開胃健脾丸收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第五冊）》［1］，質(zhì)量標準中僅對該制劑的性狀、顯微鑒別和丸項通則檢查進行了規(guī)定，不能全面、準確地評價其整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜法能較全面地反映出其內(nèi)含化學成分的種類及數(shù)量，已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量監(jiān)測和評價領(lǐng)域［9-11］。在開胃健脾丸的制備工藝中，大量使用到的煉蜜易受細菌微生物的污染，必須采取滅菌措施。常用滅菌方式有濕熱滅菌、干熱滅菌、輻射滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌等，而60Co-γ輻照滅菌法作為中成藥滅菌的一種新型高效方法，利用電離射線來破壞細菌中蛋白質(zhì)的合成，從而達到殺菌效果，具有穿透力強、不需要添加任何化學試劑，且可在常溫下進行滅菌等優(yōu)點［12-14］。本研究中為考察60Co-γ射線對開胃健脾丸輻照滅菌的可行性，建立了開胃健脾丸高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，考察不同輻照劑量60Co-γ射線輻照滅菌對指紋圖譜的影響，并比較制劑主要成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷和橙皮苷的含量變化，為開胃健脾丸采用60Co輻照滅菌提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，包括G1311A型四元梯度泵、G1329A型自動進樣器、G1314B-型二極管陣列檢測器、G1316A型柱溫箱、Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；AUW-220D型電子天平（日本Shimadzu公司）；60Co-γ射線輻照設(shè)備（深圳市金鵬源輻照技術(shù)有限公司）；LRH-150B型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；ZOZ-AB型電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；YJ-875型醫(yī)用凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；明澈-D24UV型純水/超純水一體化系統(tǒng)（德國默克密理博公司）。

1.2 試藥

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品（批號為111975-201501，含量99.9%），白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枮?11976-201501，含量99.9%），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（批號為111978-201501，含量 99.9%），黨參炔苷對照品（批號為111732-201607，含量99.9%），橙皮苷對照品（批號為110721-201316，含量95.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；沙氏瓊脂培養(yǎng)基（批號為181209），胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（批號為180916），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號為181221），均購自北京三藥科技開發(fā)公司；乙腈為色譜純；甲醇為優(yōu)級純；水為超純水。開胃健脾丸［李時珍醫(yī)藥集團有限公司，批號分別為201712012（S1）、 201801132（S2）、 201802192（S3）、201804152（S4）、 20180562（S5）、 201806162（S6）、201809112（S7）、 201810232（S8）、 201811162（S9）、201812142（S10）、201711122（S11）、201710232（S12）、201709082（S13）、201901162（S14），規(guī)格為每瓶 60 g］。

2 方法與結(jié)果2.1

色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5% 甲酸溶液（B），梯度洗脫（見表 1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm（檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及黨參炔苷）、275 nm（檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）、300 nm（檢測橙皮苷）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；色譜記錄時間：55 min［15-17］。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：稱取待測成分對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶液超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）溶解，制成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷和橙皮苷質(zhì)量濃度分別為0.4335，0.3486，0.3057，0.213 9，0.142 2 mg/mL的混合對照品溶液；分別精密量取 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置 50 mL 容量瓶中，以甲醇定容，制得系列混合對照品溶液，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

供試品溶液：取樣品及經(jīng)不同輻照劑量處理的樣品內(nèi)容物各適量，剪碎，混勻，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取未經(jīng)輻照的供試品溶液（S9）1份，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷和橙皮苷峰面積的RSD分別為0.35%，0.42%，0.57%，0.66%，0.48%（n=6）。以第1份指紋圖譜為對照，計算6份圖譜相似度，結(jié)果各圖譜相似度均大于0.98，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：室溫下取未經(jīng)輻照的供試品溶液（S9），按 2.1 項下色譜條件，分別于 0，4，8，12，16，20，24 h時進樣，記錄色譜圖，以0 h樣品指紋圖譜為對照，計算7份圖譜的相似度，并計算5種有效成分峰面積的RSD。結(jié)果各圖譜相似度均大于0.99，且白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷和橙皮苷峰面積的RSD分別為 0.57%，0.65%，0.82%，0.79%，1.02%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取同未經(jīng)輻照的樣品（S9）6份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷和橙皮苷含量分別為1.001 7，0.643 9，0.552 1，0.460 4，0.298 9 mg/g，RSD分別為 0.67% ，0.59% ，1.02%，1.01%，0.86%（n=6）。以第 1份指紋圖譜為對照，計算6份圖譜相似度，結(jié)果相似度均大于0.96，表明方法重復性良好。

線性關(guān)系考察：精密量取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以進樣量（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍。精密量取混合對照品溶液，用甲醇逐步稀釋，按2.1項下色譜條件進樣分析，取峰面積信噪比（S/N）10∶1計算定量限。結(jié)果見表2。

表2 5個有效成分的線性范圍和定量限

加樣回收試驗：取樣品（S9）6份，每份 1.0 g，精密稱定，精密加入各待測成分對照溶液2.0 mL，依法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 開胃健脾丸5個成分的加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4 指紋圖譜建立及部分共有峰指認

取14批經(jīng)0，3，5，8 kGy劑量輻照處理的樣品適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A版）軟件，設(shè)置時間窗為0.2 min，采用中位矢量法多點校正，分別生成各對照指紋圖譜。詳見圖1。

指紋圖譜中，14批供試品均檢測到24個共有峰，通過與對照品比對，可確認5號峰為橙皮苷（12.215 min），15號峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（26.005 min），16號峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（29.011 min），17 峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（30.946 min），23號峰為黨參炔苷（39.107 min）。

圖1 開胃健脾丸高效液相色譜指紋圖譜

取供試品指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A版）軟件，以未輻照（0 kGy）樣品圖譜為參照，經(jīng)多點校正，全譜段峰匹配，生成對照圖譜，計算各批不同輻照劑量與對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果見表4?？梢?，輻照前后各批次指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均大于0.90，相似度良好。

表4 指紋圖譜相似度計算結(jié)果

2.5 樣品含量測定

取樣品及60Co-γ射線輻射滅菌樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷和橙皮苷含量，利用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對滅菌前后的含量進行配對t檢驗，考察 0，3，5，8 kGy輻照劑量60Co-γ 射線輻射滅菌對各化合物含量的影響。結(jié)果見表5。

2.6 含菌量測定

分別取輻照前后的樣品，參照2015年版《中國藥典（四部）》“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”［18］進行需氧菌總數(shù)以及霉菌和酵母菌總數(shù)考察。分別加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，浸泡分散，充分振搖，按10倍培養(yǎng)基稀釋法檢查制成1∶10、1∶100、1∶1 000的待測液，依法測定需氧菌總數(shù)以及霉菌和酵母菌總數(shù)。測定結(jié)果見表6。

表5 開胃健脾丸5個成分含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 滅菌效果檢查

60Co-γ射線輻照滅菌處理后，需氧菌以及霉菌和酵母菌總數(shù)均大幅減少，且隨著輻照劑量的增加，樣品的含菌量顯著減少，表明60Co-γ射線輻照能有效除去開胃健脾丸中的微生物。

續(xù)表5 開胃健脾丸5個成分含量測定結(jié)果（mg/g）

表6 樣品輻照前后含菌量測定結(jié)果

3.2 輻照劑量選擇

根據(jù)衛(wèi)生部頒布的《60Co輻照中藥滅菌劑量標準》的規(guī)定，中藥的輻照劑量應(yīng)水平10 kGy。本研究中分別采用3，5，8 kGy劑量進行輻照，考察其對指紋圖譜和指標成分的影響，并確定最佳滅菌處理參數(shù)。開胃健脾丸經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻射處理后，0，3，5 kGy輻照處理過的供試品指紋圖譜相似度均大于0.95，而輻照劑量為 8 kGy時，相似度平均值為 0.900 6（小于0.95），表明雖然指紋圖譜共有峰數(shù)量沒有變化，但與未經(jīng)輻照的供試品比較，相似度已有所下降。輻照前后開胃健脾丸中5個成分含量無顯著性變化（P＞0.05），故從含量和共有峰數(shù)量方面可以看出，輻照滅菌對開胃健脾丸無影響。

3.3 方法的價值

本研究中建立了開胃健脾丸指紋圖譜和5個成分含量測定方法，具有良好的精密度、準確性及線性關(guān)系，輻照前后指紋圖譜相似度好，主要色譜峰未損失，通過驗證確定，當輻照劑量為8 kGy時，能有效控制微生物限度，該結(jié)論可為開胃健脾丸輻照滅菌提供參考。