胡青峰，趙宏磊，白濤，薛金熔，劉永民，孫立忠

血管新生是傷口愈合和恢復(fù)血液流通的關(guān)鍵，常會(huì)引起血管增生、腫瘤等疾病的發(fā)生[1]。人纖溶酶原Kringle 5（K5）是眾多血管抑制分子中活性較強(qiáng)且比較穩(wěn)定的血管增生抑制因子，其可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而對(duì)于其作用機(jī)制尚不清楚[2-4]。生存素（Survivin）是一種凋亡抑制蛋白，影響多種細(xì)胞凋亡過(guò)程，在腫瘤、瘢痕增生等多種疾病發(fā)生過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[5,6]。研究表明，生存素與血管瘤的消退、增生等有關(guān)，具有促進(jìn)血管瘤增生的作用[7]。本文以血管內(nèi)皮細(xì)胞為分析對(duì)象，探討生存素在K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，為明確K5抑制血管增生機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料健康產(chǎn)婦分娩新生兒臍帶由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院提供；pEGFP-N3/生存素由廣東醫(yī)谷醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；重組蛋白K5由廣東醫(yī)谷醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京Enogene；qRT-PCR購(gòu)自北京百奧萊博；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；生存素、引物由南京金斯瑞合成；細(xì)胞色素C（Cyt C）抗體、生存素抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；JC-1線粒體膜電位（△Ψm）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天（有很多公司，請(qǐng)標(biāo)明清楚）；Caspase-3、9活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊公司；三磷酸腺苷（ATP）含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成；活性氧（ROS）含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海翊圣。

1.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及分組血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[8]，取新生兒臍帶，在臍靜脈內(nèi)添加0.25%的胰蛋白酶使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。用胎牛血清終止消化以后。用10%胎牛血清的M199懸浮細(xì)胞，種植到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。12 h后把未貼壁的細(xì)胞洗滌掉。細(xì)胞密度約為90%，用0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔?，取?代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)間接免疫熒光法顯示Von Willebrand因子呈陽(yáng)性，鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分組血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N3/生存素和對(duì)照載體pEGFP-N3后，在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)用含有640 nmol/L的K5的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)分別記為K5+生存素和K5+NC（對(duì)照組）。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)。同時(shí)以不做任何處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞記為Control（空白組），以不做轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在0 h時(shí)用含有640 nmol/L的K5的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為K5。同時(shí)Control、K5、K5+NC、K5+生存素細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)分別添加20 ng/ml的bFGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，各組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中均不添加胎牛血清。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)K5作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中生存素表達(dá)Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，提取細(xì)胞RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組細(xì)胞中RNA的濃度。用qRT-PCR檢測(cè)生存素mRNA的水平，以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算。

1.5 Western blot檢測(cè)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞生存素的表達(dá)Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，提取細(xì)胞總蛋白。用90 V電壓進(jìn)行電泳。把蛋白在200 mA恒流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白于室溫封閉。與1∶600稀釋的生存素抗體在4 ℃中孵育，再與1∶2000稀釋的二抗在室溫孵育。ECL發(fā)光以后，用Quantity One對(duì)各組條帶的灰度值進(jìn)行分析，用生存素的灰度值與GAPDH的灰度值表示生存素蛋白水平。

1.6 細(xì)胞凋亡測(cè)定細(xì)胞凋亡測(cè)定用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細(xì)胞，加入約500 μl的Binding buffer，混合后，再添加PI和Annexin V-FITC 5 μl，避光反應(yīng)約15 min，每隔3 min混合1次，在1 h內(nèi)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.7 線粒體膜電位測(cè)定Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細(xì)胞，用JC-1法測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。結(jié)果以實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的紅色熒光/綠色熒光同Control細(xì)胞的紅色熒光/綠色熒光的比值表示△Ψm。

1.8 ATP含量測(cè)定Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細(xì)胞，用比色法測(cè)定細(xì)胞勻漿液中ATP含量，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細(xì)胞，用比色法測(cè)定細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果以實(shí)驗(yàn)細(xì)胞A值與Control細(xì)胞A值的比值表示Caspase-3、Caspase-9活性。

1.10 胞質(zhì)和線粒體中Cyt C表達(dá)檢測(cè)Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細(xì)胞，提取胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白，用Western blot法測(cè)定胞質(zhì)和線粒體中Cyt C的表達(dá)，步驟同上。線粒體中Cyt C蛋白水平以Cyt C灰度值÷porin灰度值表示，胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平以Cyt C灰度值÷GAPDH灰度值表示。

1.11 ROS含量檢測(cè)Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次以后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞熒光強(qiáng)度與Control細(xì)胞熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)K5誘導(dǎo)后細(xì)胞中生存素表達(dá)Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細(xì)胞中生存素mRNA水平依次為：1.00、0.37±0.03、0.36±0.04、0.74±0.02，蛋白水平依次為：0.87±0.06、0.21±0.04、0.21±0.06、0.44±0.04。Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細(xì)胞中生存素mRNA和蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=398.448，P1=0.000，F(xiàn)2=111.721，P2=0.000），K5細(xì)胞中生存素mRNA和蛋白表達(dá)均低于Control組（P＜0.05）。K5+生存素細(xì)胞中生存素mRNA和蛋白表達(dá)均高于K5（P＜0.05）。K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中生存素的表達(dá)下調(diào)，而轉(zhuǎn)染生存素真核表達(dá)載體以后可以有效促進(jìn)細(xì)胞中生存素的表達(dá)（圖1）。

圖1 Western blot測(cè)定轉(zhuǎn)染以后的細(xì)胞經(jīng)K5誘導(dǎo)后Survivin蛋白表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)生存素減少K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細(xì)胞凋亡率依次為：（3.69±2.54）%、（36.58±3.97）%、（37.46±3.65）%、（22.64±1.47）%，4組細(xì)胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.843，P=0.000）。K5細(xì)胞凋亡率高于Control（P＜0.05）。K5+生存素細(xì)胞凋亡率低于K5（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)生存素降低細(xì)胞凋亡水平（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定生存素對(duì)K5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響

2.3 生存素減弱K5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位和ATP合成的影響Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細(xì)胞線粒體膜電位△Ψm依次為：1.00、0.44±0.05、0.43±0.05、0.85±0.10，ATP合成水平依次為：1.00、0.65±0.10、0.68±0.06、0.91±0.05。4組細(xì)胞△Ψm和ATP水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=67.040，P1=0.000，F(xiàn)2=22.826，P2=0.000），K5細(xì)胞△Ψm和ATP水平均低于Control（P＜0.05）。K5+NC細(xì)胞△Ψm和ATP水平與K5比較沒(méi)有變化（P＞0.05）。K5+生存素細(xì)胞△Ψm和ATP水平均高于K5（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞△Ψm升高，減少ATP合成，而生存素可以減弱K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞△Ψm下降和ATP合成減少。

2.4 生存素減弱K 5 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活化影響4組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=38.321，P1=0.000，F(xiàn)2=64.518，P2=0.000），K5細(xì)胞Caspase-3、9活性均高于Control（P＜0.05）。K5+生存素細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性均低于K5（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9的活化，而生存素可降低K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活化水平（圖3）。

圖3 生存素對(duì)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活化影響：A.生存素對(duì)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3活化水平影響；B.生存素對(duì)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-9活化水平影響；與Control相比，aP＜0.05；與K5相比，bP＞0.05；與K5相比，cP＜0.05

2.5 生存素降低K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體釋放Cyt CControl、K5、K5+NC、K5+生存素組細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白水平依次為：1.13±0.08、0.35±0.04、0.35±0.05、0.57±0.05，胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平依次為：0.15±0.05、0.81±0.09、0.79±0.13、0.31±0.03。4組細(xì)胞線粒體及胞質(zhì)中的Cyt C蛋白水平整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=125.169，P1=0.000，F(xiàn)2=47.592，P2=0.000），K5細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白水平低于Control，而胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平明顯高于Control，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。K5+生存素細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白水平明顯高于K5，而胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平低于K5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體釋放Cyt C，而生存素可以減少K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放Cyt C（圖4）。

圖4 生存素對(duì)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體中Cyt C蛋白影響：A.Western blot測(cè)定生存素對(duì)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)；B.Western blot測(cè)定生存素對(duì)K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中Cyt C蛋白表達(dá)

2.6 生存素降低K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS水平Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細(xì)胞中ROS水平依次為：1.00、2.78±0.17、2.77±0.10、1.84±0.12。4組細(xì)胞的ROS水平整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=164.268，P=0.000），K5細(xì)胞中ROS水平高于Control（P＜0.05）。K5+NC細(xì)胞中ROS水平與K5比較無(wú)明顯變化（P＞0.05）。K5+生存素細(xì)胞中ROS水平低于K5（P＜0.05）。K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS升高，過(guò)表達(dá)生存素降低細(xì)胞中ROS水平。

3 討論

本組結(jié)果顯示，K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率增加，K5通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)K5作用后細(xì)胞中生存素水平降低，生存素過(guò)表達(dá)可以通過(guò)線粒體途徑減少K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

K5是纖溶酶原的抗血管增生中活性最強(qiáng)的裂解片段[9]。研究顯示，K5可以抑制視網(wǎng)膜血管增生大鼠新生血管的形成[10]。文獻(xiàn)報(bào)道重組K5蛋白可以在體外誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，影響Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[11]。

生存素由142個(gè)氨基酸組成，能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡和血管形成，在bFGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)升高，而bFGF是公認(rèn)的促進(jìn)血管形成的分子，腫瘤壞死因子等炎癥因子不能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中生存素表達(dá)升高[12-14]。研究顯示，生存素表達(dá)下調(diào)后可抑制移植靜脈小鼠內(nèi)膜的增生[15]。正常情況下，生存素在非增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平極低，而在肉芽所產(chǎn)生的新生血管中其表達(dá)水平異常升高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中生存素水平降低，提示K5可能通過(guò)降低生存素的表達(dá)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生與線粒體膜電位降低有關(guān)，而線粒體膜電位下降與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放密切相關(guān)，當(dāng)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放后，位于線粒體內(nèi)的Cyt C進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17]。ROS主要是由線粒體產(chǎn)生，而ROS的作用靶點(diǎn)也主要是線粒體，ROS可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，引起線粒體腫大，導(dǎo)致氧化磷酸化及呼吸鏈異常，引起ATP合成減少，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ATP的合成減少，線粒體膜電位下降，細(xì)胞中ROS水平升高，線粒體釋放到胞質(zhì)中的Cyt C也增加，說(shuō)明K5可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而生存素可升高K5作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位，促進(jìn)ATP的合成，減少Caspase-3和Caspase-9的活化，減少線粒體釋放到胞質(zhì)中的Cyt C，提示生存素在K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中具有重要作用，作用機(jī)制與線粒體途徑有關(guān)。

綜上，生存素影響K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在線粒體膜電位調(diào)控、ATP合成、ROS產(chǎn)生中具有重要作用，參與血管增生，這對(duì)于以后研究K5抑制血管增生的作用機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)尚未探討生存素和K5在體內(nèi)血管增生中的作用，在以后實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)這一部分進(jìn)行深入分析。