劉 慧 李松蓮 譚程丹 凌 潔 黃維芳 劉麗芳

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007 2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410207

乳腺增生是女性最常見(jiàn)的乳房疾病，臨床表現(xiàn)為一側(cè)或兩側(cè)乳房結(jié)節(jié)、乳腺增大、局部周期性疼痛等，多見(jiàn)于30～50歲女性，男性也可發(fā)生。不典型增生屬于乳腺高危病變，其發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性明顯增加[1]。乳腺增生的發(fā)生，本質(zhì)上是由于乳腺主質(zhì)和間質(zhì)不同程度地增生與復(fù)舊不全所致的乳腺正常結(jié)構(gòu)紊亂，可能與卵巢功能失調(diào)有關(guān)，也可能為黃體素與雌激素比例不平衡所致，目前尚無(wú)定論，多認(rèn)為與體內(nèi)內(nèi)分泌紊亂及激素水平失調(diào)有關(guān)。西醫(yī)主要采取激素類(lèi)藥物治療，易反復(fù)而難治愈，或手術(shù)切除增生腫塊，增加患者的精神負(fù)擔(dān)。乳痛軟堅(jiān)片是本院院內(nèi)制劑，已經(jīng)在臨床上使用多年，成分穩(wěn)定[2]，療效確切。本研究將進(jìn)一步從激素水平探討其治療乳腺增生的作用機(jī)理，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只健康未孕雌性SD大鼠，SPF級(jí)，70～80日齡，體重180～230 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(湘)2009-0012。全價(jià)顆粒飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)提供，批號(hào)100811。

1.2 藥物

乳痛軟堅(jiān)片，由柴胡、陳皮、川楝子、延胡索、莪術(shù)、當(dāng)歸、白芍、黨參、浙貝母、海蛤粉、甘草等中藥組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備(規(guī)格0.3 g×100片，湘藥制字Z20160364，批號(hào)161009)。紅金消結(jié)濃縮丸，由金蕎麥、三七、五香血藤、柴胡、八角蓮、大紅袍、香附、鼠婦蟲(chóng)、黑螞蟻、雞矢藤等中藥組成，云南楚雄云中制藥有限公司(規(guī)格0.2 g×60丸，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20160511，批號(hào)160514)。黃體酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020534，批號(hào)1612091)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020529，批號(hào)1605061)。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：大鼠雌激素ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)DRG，批號(hào)JKSJ-2636)；大鼠孕激素ELISA檢測(cè)試劑盒(cusabio，批號(hào)CSB-E07282r)；大鼠泌乳素ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢純度生物，批號(hào)CD-108818-ELISA)；磷酸緩沖鹽溶液、枸櫞酸鈉緩沖液均由博士德提供；無(wú)水乙醇、蘇木素、鹽酸、二甲苯、多聚甲醛、0.9%NaCl注射液等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：三目生物顯微鏡(Carl Zeiss 3120000469)，電子天平(WTI1001R)，圖像分析系統(tǒng)(Motic Images Advanced 3.2)，生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，生物組織包埋中心，石蠟切片機(jī)(DQP-9010)，攤片烤片機(jī)，微波爐，電子恒溫水浴箱，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫電烤箱，自制大鼠灌胃器，鑷子，自制大鼠固定器，試管架，蓋玻片，移液器等。

1.4 動(dòng)物模型的制備

60只SD大鼠，自由進(jìn)水、進(jìn)食，12 h明暗交替，室溫20℃～23℃，相對(duì)濕度55%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。正常對(duì)照組(A組10只)大鼠大腿外側(cè)肌注0.9%NaCl注射液(0.5 mg/kg)，1次/d，連續(xù)30 d。參照文獻(xiàn)[3]制備乳腺增生肝郁痰凝型大鼠模型，模型制備組(50只)肌注苯甲酸雌二醇注射液(0.5 mg/kg)，1次/d，持續(xù)25 d；接著肌注黃體酮注射液(4 mg/kg)，1次/d，持續(xù)5 d；模型制備組同時(shí)予以每日夾尾(距尾巴末梢25 cm的地方)刺激30 min，共30 d。

造模后，模型動(dòng)物出現(xiàn)性情改變，毛色枯黃，體重增加減慢甚至停滯等現(xiàn)象；肉眼觀察，模型動(dòng)物的乳頭高度及直徑、乳房毛發(fā)裸露區(qū)直徑明顯大于正常對(duì)照組；隨機(jī)抽取10只模型制備組大鼠、2只正常對(duì)照組大鼠，取大鼠的前1對(duì)或2對(duì)乳房做病理切片，光鏡下顯示模型制備組較正常對(duì)照組大鼠乳腺小葉數(shù)目增多、腺泡明顯擴(kuò)張等乳腺增生病理改變，血清雌激素水平顯著升高等，表示造模成功。

1.5 動(dòng)物干預(yù)方法

對(duì)造模成功的大鼠進(jìn)行隨機(jī)均衡分組，A組仍為正常對(duì)照組，B組為模型對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組設(shè)C、D、E組分別為乳痛軟堅(jiān)片低、中、高劑量組，F(xiàn)組為紅金消結(jié)濃縮丸陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只大鼠。乳痛軟堅(jiān)片中劑量組換算為臨床日用量等效劑量，低、中、高劑量組按1：2：4比例用藥，分別為0.32 g/kg、0.64 g/kg、1.28 g/kg；F組給藥劑量為0.55 g/kg。藥物研末，分別稱(chēng)取，用蒸餾水溶解稀釋?zhuān)糜?℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩、B組大鼠灌以10 mL/kg的生理鹽水，C、D、E、F各組每日以10 mL/kg的藥物溶劑灌胃，連續(xù)灌胃1個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠均成活。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

①大鼠行為學(xué)指標(biāo) 觀察大鼠是否存在“皮毛欠光、豎毛、脫毛、弓背、怕冷、倦怠、反應(yīng)遲鈍、易激惹、急躁”等反應(yīng)，分別按“無(wú)、輕微、明顯”計(jì)0、1、2分[4]；9項(xiàng)總分為0～5分者終得分計(jì)為0分，6～11分者終得分計(jì)為1分，12～18分者終得分計(jì)為2分。

②乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑 對(duì)大鼠乳房外形進(jìn)行觀察，用游標(biāo)卡尺對(duì)雙側(cè)第2對(duì)乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑進(jìn)行精確測(cè)量。

③血清E2、P、PRL水平 于末次給藥后1 h，大鼠尾靜脈采血，離心取血清，分裝后冷凍保存，采用酶聯(lián)免疫分析方法，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測(cè)血清E2、P、PRL水平。

④乳腺病理觀察 脫頸椎處死大鼠，用20%Na2S脫毛，取大鼠第2、3對(duì)乳房，分別用10%福爾馬林固定24 h；經(jīng)過(guò)脫水、透明、透蠟、包埋、切片、展片、烤片、HE染色等處理后進(jìn)行鏡檢。光鏡下觀察乳腺組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用圖像分析軟件采集圖像并測(cè)量乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)，每張病理切片觀測(cè)3個(gè)視野后取其平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)評(píng)分及乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑

造模后，與A組比較，B、C組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著升高(P<0.05)。治療后，與B組比較，D、E、F組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05)；與C組比較，D、E、F組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05)。

造模后，與A組比較，B、C、D、E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑均顯著增大(P<0.05)。治療后，與B組比較，D、E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯縮小(P<0.05)；與C組比較，D、E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯縮小(P<0.05)；與D組比較，E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯縮小(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分及乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05；與D組比較，□P<0.05

2.2 乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生層數(shù)

造模后，B組大鼠乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生層數(shù)明顯多于A組(P<0.05)；治療后，E組大鼠乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生層數(shù)明顯少于B組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生層數(shù)

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

2.3 血清E2、P、PRL水平比較

造模后，B組大鼠血清E2、PRL水平明顯高于A組，血清P水平明顯低于A組(P<0.05)；治療后，D、E、F組大鼠血清E2水平顯著低于B組(P<0.05)，F(xiàn)組大鼠血清P水平顯著高于B組(P<0.05)，E、F組大鼠血清PRL水平顯著低于B組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清E2、P、PRL水平比較

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

3 討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，乳腺增生與下丘腦-垂體-卵巢-乳腺內(nèi)分泌軸紊亂有關(guān)，雌、孕激素比例失調(diào)使乳腺在雌激素的刺激下實(shí)質(zhì)增生過(guò)度和復(fù)舊不全[5]，而PRL水平長(zhǎng)期升高不僅可直接刺激腺泡增生，還可通過(guò)刺激雌激素的產(chǎn)生及對(duì)孕激素的抑制從而導(dǎo)致乳腺腺體增生[6]。枸櫞酸他莫昔芬片為一種雌激素受體拮抗劑，結(jié)構(gòu)類(lèi)似雌激素，能與E2競(jìng)爭(zhēng)雌激素受體并形成穩(wěn)定復(fù)合物，導(dǎo)致雌激素?zé)o法發(fā)揮作用，雖可應(yīng)用于治療乳腺增生、預(yù)防乳腺癌，但不良反應(yīng)較多而難以被患者接受[7]。

情志因素所導(dǎo)致的肝氣不舒是肝郁氣滯型乳腺增生疾病發(fā)生的最主要原因，其主要機(jī)理為肝郁氣滯，日久痰凝血瘀，形成增生結(jié)節(jié)伴疼痛。乳痛軟堅(jiān)片是本院經(jīng)典制劑，具有疏肝解郁、化痰散結(jié)、活血止痛之功，成分穩(wěn)定，療效確切，并具有降低大鼠乳腺增生組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，抑制新生血管形成，降低微血管密度(MVD)，改善腺體微循環(huán)及病理性增生的作用[8]。其基本藥物組成為柴胡、陳皮、川楝子、延胡索、當(dāng)歸、白芍、莪術(shù)、海蛤粉、浙貝母、黨參、甘草等。柴胡解表退熱、疏肝解郁，陳皮理氣健脾、燥濕化痰，川楝子行氣止痛，延胡索活血、行氣、止痛，當(dāng)歸補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血止痛，白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)，莪術(shù)破血行氣、消積止痛，海蛤粉清肺化痰、軟堅(jiān)散結(jié)，浙貝母清熱化痰、散結(jié)消癰，黨參補(bǔ)脾肺氣、補(bǔ)血生津，甘草補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和藥性；全方配伍，共奏疏肝解郁、化痰散結(jié)、活血止痛之功。

本研究結(jié)果表明，造模后大鼠出現(xiàn)“倦怠、弓背、怕冷、豎毛、皮毛欠光、脫毛、反應(yīng)遲鈍、易激惹、急躁”等行為學(xué)表現(xiàn)，行為學(xué)評(píng)分顯著升高；肉眼觀察大鼠乳房可見(jiàn)乳頭周?chē)l(fā)裸區(qū)直徑明顯變大并隆起；乳腺組織可見(jiàn)到典型的乳腺增生灶，導(dǎo)管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、增生層數(shù)明顯增多；血清E2、PRL水平明顯升高，血清P水平明顯降低，表明肝郁痰凝型乳腺增生大鼠造模成功。治療后，大鼠行為學(xué)評(píng)分下降，乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑縮小，乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列基本規(guī)則、增生層數(shù)減少，血清E2、PRL水平降低，血清P水平升高，表明乳痛軟堅(jiān)片干預(yù)后均出現(xiàn)不同程度的改善。本課題組前期臨床觀察[9]、徐玲[10]等研究發(fā)現(xiàn)疏肝活血藥物可改善患者性激素水平，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，乳痛軟堅(jiān)片干預(yù)肝郁痰凝型乳腺增生大鼠可降低行為學(xué)評(píng)分，縮小乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑，減少乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生，降低血清E2、PRL水平，升高血清P水平，且高劑量乳痛軟堅(jiān)片療效更為顯著。