李賢見 黃裕林 黎妮 朱興春

重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 405499

人類血小板表面含有許多復(fù)雜的血型抗原，機(jī)體在輸血、妊娠、器官移植等情況下刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生血小板同種抗體[1]。母嬰間如存在血型不合，可刺激母體產(chǎn)生針對胎兒血小板的血小板抗體，導(dǎo)致流產(chǎn)和新生兒同種免疫性血小板減少癥的發(fā)生[2-4]。因此對孕婦進(jìn)行產(chǎn)前血小板抗體的篩查相當(dāng)必要。為了解孕期孕婦體內(nèi)血小板抗體狀況，本研究采用問卷調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測等方法對984例不同孕周的孕婦進(jìn)行了調(diào)查，分析引起孕婦產(chǎn)生血小板抗體的危險(xiǎn)因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2016年1月至2018年12月來本院進(jìn)行產(chǎn)檢的孕期大于12周的984例孕婦為研究對象。年齡18～45歲，中位年齡27歲；其中年齡≤20歲8例，20～29歲630例，30～39歲285例，≥40歲61例；孕12～16周208例，孕17～21周264例，孕22～26周265例，孕27～31周164例，≥32周83例；經(jīng)問卷調(diào)查：無流產(chǎn)史者904例，有流產(chǎn)史者80例，其中1次流產(chǎn)45例，2次流產(chǎn)21例，2次以上流產(chǎn)14例；1次妊娠者450例，2次妊娠者250例，3次妊娠者200例，3次以上妊娠者84例；有分娩史的孕婦284例，其中經(jīng)陰道產(chǎn)170例，經(jīng)剖宮產(chǎn)114例；A型血孕婦217例，B型血孕婦246例，AB型血孕婦283例，O型血孕婦238例。所有研究對象均無輸血史，意外抗體篩查均為陰性。

1.2 儀器與試劑

血小板抗體檢測采用美國BD公司產(chǎn)的流式細(xì)胞儀FACSCalibur，一次性用Falcon 管，PBS緩沖液（1g/L疊氮鈉），固定液（0.1%多聚甲醛），美國BD公司購買的FITC-羊抗人IgG，實(shí)驗(yàn)室自備的血小板抗原譜細(xì)胞。

1.3 血小板檢測方法

選取O型血小板供給者，利用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異引物技術(shù)（PCR-SSP）對其進(jìn)行HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-15的系統(tǒng)分型，盡量選擇純合子（a/a和b/b）的O型血小板抗原譜細(xì)胞，組成可鑒定HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-15抗體特異性的血小板譜抗原。將Falcon 管中加入事先制備好的實(shí)驗(yàn)室自備血小板抗原譜細(xì)胞[5]，每管加入1.5×107個(gè)血小板，然后加入50uL患者血清并室溫孵育30min，800r/min離心5min，加入PBS緩沖液洗滌2次，再加入10uLFITC-羊抗人IgG混勻避光孵育25min后加入PBS緩沖液和固定液上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)陰性對照管為空白管，陽性對照管加入血小板和陽性血清。

1.4 結(jié)果判讀

以FSC/SSC設(shè)置血小板門，調(diào)節(jié)FSC閾值，去除碎片干擾，獲取血小板的熒光強(qiáng)度。FSC/SSC散點(diǎn)圖的100～101區(qū)域?yàn)殛幮詫φ占?xì)胞群著落點(diǎn)，為排除細(xì)胞碎片和熒光染料非特異性吸附的干擾，血小板抗體陽性結(jié)果為檢測的熒光強(qiáng)度幾何均數(shù)值大于陰性對照的2倍。

1.5 問卷調(diào)查

自制調(diào)查問卷，調(diào)查孕婦年齡、孕產(chǎn)史、分娩方式等情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用spss21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析，多因素分析采用Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板抗體檢測結(jié)果

984例孕婦中58例檢出血小板抗體陽性，陽性率為5.89%。

2.2 引起孕婦產(chǎn)生血小板抗體的相關(guān)因素的單因素分析

不同年齡、不同分娩方式、不同血型間血小板抗體檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同流產(chǎn)次數(shù)、妊娠次數(shù)、孕周之間血小板抗體檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血小板抗體影響因素的單因素分析

表2 多因素Logistic回歸分析

2.3 多因素分析

將單因素分析篩選出來的3個(gè)危險(xiǎn)因素流產(chǎn)次數(shù)、妊娠次數(shù)、孕周為自變量，以是否產(chǎn)生血小板抗體為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示流產(chǎn)次數(shù)、妊娠次數(shù)、孕周是孕婦產(chǎn)生血小板抗體的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2。

3 討論

血小板表面具有復(fù)雜的血型抗原，這些血型抗原通常分為兩類：一類為主要與紅細(xì)胞ABO血型系統(tǒng)和人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）有關(guān)的血小板相關(guān)抗原；另一類為由血小板特有的抗原決定簇組成的血小板特異性抗原(human platelet antigen，HPA)。血小板抗體也分為兩類：一類為針對紅細(xì)胞ABO血型系統(tǒng)和HLA系統(tǒng)產(chǎn)生的血小板抗體；另一類為針對HPA產(chǎn)生的特異性抗體。血小板血型抗原不合可引起機(jī)體針對HLA抗原和HPA抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而產(chǎn)生血小板抗體，輸血和妊娠可誘導(dǎo)這種免疫反應(yīng)的發(fā)生[6-9]。當(dāng)母胎間血小板表面抗原不合時(shí)，如胎兒的血小板進(jìn)入母體血液循環(huán)，可刺激母體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生血小板抗體，這種抗體主要為IgG類抗體，該類抗體又可通過胎盤屏障被吸收到胎兒體內(nèi)，并與胎兒血小板表面的抗原相結(jié)合，后者又被體內(nèi)的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除使胎兒的血小板數(shù)目減少，引起早期流產(chǎn)或者新生兒同種免疫性血小板減少癥。血小板抗體是引起流產(chǎn)和新生兒同種免疫性血小板減少癥的直接致病抗體，新生兒同種免疫性血小板減少癥發(fā)病較急，常導(dǎo)致胎兒或新生兒出現(xiàn)血小板嚴(yán)重減少及顱內(nèi)出血[10],病死率可達(dá)9%～46%[11]。

血小板抗體有多種檢測方法，例如單克隆抗體固相血小板抗體實(shí)驗(yàn)（MASPAT法）、改良單克隆抗體血小板抗原固定實(shí)驗(yàn)（MAIPA法）、流式細(xì)胞術(shù)等。MAIPA法是血小板抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，流式細(xì)胞術(shù)法與MAIPA法的敏感性和特異性幾乎相同[12]，且耗時(shí)短、成本低。因此本次研究采用流式細(xì)胞術(shù)作為血小板抗體檢測的初篩方法，對984例孕12周以后的孕婦進(jìn)行血小板抗體檢測，有58例檢出血小板抗體陽性，陽性率為5.89%，這與國內(nèi)的相關(guān)報(bào)道相符合[13]。

多因素分析顯示流產(chǎn)次數(shù)、妊娠次數(shù)、孕周是孕婦產(chǎn)生血小板抗體的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。有文獻(xiàn)報(bào)道，有流產(chǎn)史和妊娠史的孕婦血小板抗體陽性率顯著高于無流產(chǎn)史和初次妊娠的孕婦[14-15]。本次研究顯示有流產(chǎn)史和多次妊娠史的孕婦血小板抗體陽性率分別為26.25%、8.24%，高于無流產(chǎn)史和初次妊娠的孕婦血小板抗體陽性率的4.09%、3.11%，與上述報(bào)道相符。進(jìn)一步證實(shí)了孕婦血小板抗體的產(chǎn)生與其流產(chǎn)史和妊娠史密切相關(guān)，并隨著流產(chǎn)次數(shù)和妊娠次數(shù)的增多，其血小板抗體產(chǎn)生的幾率也隨著增高。其原因是孕婦因多次流產(chǎn)和妊娠，使機(jī)體受到血小板抗原刺激的量和頻率增大，更容易引起機(jī)體發(fā)生同種免疫反應(yīng)而產(chǎn)生血小板抗體。本次研究還發(fā)現(xiàn)孕婦血小板抗體的產(chǎn)生與孕婦的孕周相關(guān)，孕中期隨著孕周增加，血小板抗體陽性率逐漸增高。據(jù)報(bào)道，在妊娠第10周以后胎兒就具有了刺激母體免疫系統(tǒng)的抗原[16]，孕婦的孕周越大，胎兒的血小板抗原刺激母體免疫系統(tǒng)的時(shí)間和頻率就越多，極易使母體產(chǎn)生血小板抗體。第27周以后血小板抗體陽性率有所降低，考慮可能因?yàn)檠“蹇贵w效價(jià)低造成漏檢所致，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。另外，本次研究有1例無流產(chǎn)史且為初次妊娠的孕婦檢出有血小板相關(guān)抗體，經(jīng)詢問也無輸血史，此情況考慮可能為某些藥物引起血小板相關(guān)抗體的產(chǎn)生。

綜上所述，隨著二胎政策的開放，為確保優(yōu)生優(yōu)育，對孕婦特別是有流產(chǎn)史和妊娠史的孕婦進(jìn)行血小板抗體篩查非常必要，可早期評估流產(chǎn)和新生兒同種免疫性血小板減少癥的風(fēng)險(xiǎn)。另外，通過血小板抗體檢測，可指導(dǎo)臨床對需輸注血小板的血小板抗體陽性的孕產(chǎn)婦進(jìn)行血小板配型輸注，提高輸注有效率；避免采集攜帶有血小板抗體的血液制品應(yīng)用于臨床，造成血小板輸注無效、輸血后紫癜等輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。