周穎 陸麗華

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院 消化科，上海 200137

人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）是表皮生長因子受體家族的成員，定位于染色體17q21，編碼相對分子質(zhì)量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性[1]。HER2在乳腺癌診療中的價值已被認(rèn)可，能獨立預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)和生存期長短，并被現(xiàn)行指南作為危險分層和指導(dǎo)治療的指標(biāo)之一[2-3]。HER2過表達與胃癌預(yù)后的相關(guān)性尚不明確[4]，各項研究的結(jié)果不一，但Meta分析提示HER2基因擴增及過表達與不良預(yù)后有相關(guān)性[5-6]。文獻報道，在胃癌早期即有腫瘤細胞DNA釋放入血，檢測循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA,ctDNA）具有無創(chuàng)、實時的優(yōu)點，并且早于影像學(xué)檢查結(jié)果[7]。本研究采用前瞻性病例對照研究，采用微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR System，ddPCR）技術(shù)，對胃癌患者血清ctDNA中HER2基因擴增表達進行監(jiān)測，分析其與腫瘤組織樣本免疫組化染色(immuno-histochemistry，IHC)結(jié)果的一致性，并分析ctDNA中HER2擴增水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。觀察ctDNA中HER2表達的預(yù)測價值，為實時、無創(chuàng)檢測積累數(shù)據(jù)，以實現(xiàn)靶向藥物治療患者的精準(zhǔn)篩查，從而改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)為：1）擬接受根治術(shù)的原發(fā)性胃癌患者；2）術(shù)前無放化療史；3）臨床分期ⅢA期以下，病理組織學(xué)證實為腺癌者；4）無嚴(yán)重心肺功能障礙和其他嚴(yán)重合并癥。排除合并其它惡性腫瘤史者。

1.2 一般資料

2017年1月至2017年12月于我院確診擬采用根治術(shù)治療的原發(fā)胃癌患者中，抽取術(shù)后病理符合入組標(biāo)準(zhǔn)的100例作為胃癌組。抽取同期與胃癌組年齡、性別接近的健康體檢者50例為對照組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 樣本采集

胃癌組患者術(shù)前采血，血清標(biāo)本置于-80℃凍存待檢。術(shù)中切除的腫瘤組織使用福爾馬林固定，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進行石蠟包埋。對照組入組后采血。

1.4 免疫組化檢測

常規(guī)石蠟組織切片，厚3μm，襯于涂膠玻片上，放置烤箱中(65℃)烘烤過夜；組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟 3 min×3 次，100%、95%和 75%的酒精脫水各 2 min，自來水沖洗 2 min；3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，浸泡 10 min，PBS 沖洗 3 min×3 次；EDTA 抗原修復(fù)：不銹鋼鍋內(nèi)加入配制好的 EDTA 緩沖液，電磁爐上加熱至煮沸，將切片置于耐高溫塑料切片架中，浸入已沸騰的緩沖液中，蓋好加壓閥，保溫 20 min，停止加熱，不銹鋼鍋自然冷卻 2-3 min，自來水沖洗冷卻至室溫，打開鍋蓋，取出切片，水洗 2 min，PBS 沖洗3 min×3 次；IHC油筆在組織外圍劃圈，防止滴加的抗體流失；滴加第一抗體（HER2 抗體，抗體濃度 1：150），以 PBS 緩沖液替代第一抗體，作為空白對照，37℃濕盒內(nèi)孵育 2.5 h（或過中午），PBS 沖洗 3 min×3 次；甩去 PBS 溶液，滴加即用型二抗，室溫孵育 30 min，PBS 沖洗 3 min×3 次；滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，鏡下控制顯色時間1-3 min，不超過 5 min，水洗 2min；改良無酒精Carazzi 蘇木素液復(fù)染數(shù)秒，流水洗 5 min；顯色片過酒精后烤干，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。根據(jù)修訂的 Hercep Test 評分系統(tǒng)由 2 名專業(yè)病理醫(yī)師進行獨立評分，結(jié)果為0/陰性、1+/陰性、2+/不確定、3+/陽性。

1.5 血清ctDNA抽提

取血清350μL，加入等體積1%SDS溶液，20μL蛋白酶K（濃度為20mg/mL），混勻后60℃水浴90min。加入等體積酚：氯仿：異戊醇（5：4：1）混合溶液，劇烈震蕩，4℃靜置30min后，4℃下離心12000rpm 10min，吸取上清至新的離心管中，注意不要吸到中間乳白色液體層。加入等體積異丙醇，劇烈震蕩，-20℃靜置沉淀2h或過夜，4℃下離心12000rpm 10min，棄上清。之后用1mL 75%乙醇溶液清洗沉淀兩次，開蓋至剩余液體揮發(fā)干凈，加入ddH2O 20μl溶解沉淀，如不能溶解完全，水浴鍋中70℃水浴10min后，室溫12000rpm離心2min。

1.6 HER2的DNA標(biāo)準(zhǔn)品制備

在南京金斯瑞公司合成人HER2基因的cDNA全長作為HER2標(biāo)準(zhǔn)品，用ddH2O將其溶解為濃度100ng/μL濃度使用。將其梯度稀釋至1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL備用，作為驗證HER2引物的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 微滴式數(shù)字PCR檢測HER2基因擴增

HER2基因用FAM標(biāo)記的TaqMan探針進行檢測，同時用RPPH1基因作為參照，探針用HEX標(biāo)記，將含有樣品DNA的反應(yīng)液通過QX200微滴發(fā)生器形成油包水的微滴，然后轉(zhuǎn)移到96孔PCR板在ABI 2720 PCR基因擴增儀進行兩步法的PCR擴增，擴增程序為95℃預(yù)變性10min；接著95℃變性30sec，60℃退火1min，40個循環(huán)；隨后98℃加熱10min。最后再將PCR板轉(zhuǎn)移到QX200微滴分析儀對所有孔的樣品進行熒光檢測。HER2拷貝數(shù)為HER2基因的濃度與RPPH1基因的濃度之比。結(jié)果判讀時，相對表達量大于等于1.4倍結(jié)果判讀為陽性，小于1.4倍結(jié)果判讀為陰性。所用引物見表1。

表1 ddPCR備選引物

1.8 觀察方法

比較胃癌組與對照組HER2陽性率，比較胃癌組免疫組化和數(shù)字微滴PCR結(jié)果，術(shù)后隨訪18～24個月，比較死亡和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)后不良患者與未復(fù)發(fā)患者的HER2基因擴增結(jié)果。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對照組ctDNA的HER2陽性率比較

胃癌組血清ctDNA的HER2基因擴增結(jié)果41例陽性，陽性率41%，對照組陽性率2%，兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 胃癌組IHC檢測HER2表達與ddPCR擴增結(jié)果比較

胃癌組HER2IHC檢測2+陽性9例，3+陽性34例，陽性率43%，ddPCR的基因擴增與ICH的符合率為96%(96/100)，見表2。

表2 胃癌組HER2的IHC與ddPCR結(jié)果比較（n）

2.3 ctDNA的HER2與胃癌患者預(yù)后

100例患者中死亡11例，復(fù)發(fā)27例，預(yù)后不良率38%。ctDNA中HER2陽性患者預(yù)后不良率65.85%（27/41）,HER2陰性患者預(yù)后不良率18.64%(11/59)。HER2陽性組預(yù)后不良率顯著高于陰性組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。如圖1所示，預(yù)后不良組ctDNA中的HER2的表達量是預(yù)后良好組的8.7倍，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 預(yù)后良好與預(yù)后不良組HER2表達量

3 討論

中國屬于胃癌高發(fā)國家，每年胃癌新發(fā)病例約40萬例，死亡約35萬例，新發(fā)和死亡均占全世界胃癌病例的40%[8]，降低胃癌的發(fā)病率和死亡率是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。隨著對腫瘤發(fā)生機制的不斷研究，對腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入，腫瘤的治療也進入了一個嶄新的靶向治療時代。而發(fā)現(xiàn)新的胃癌預(yù)后靶標(biāo)、精準(zhǔn)篩選適合靶向治療的患者、監(jiān)測治療效果、評價預(yù)后成為目前的研究熱點[9]。針對HER2陽性的靶向藥物（曲妥珠單抗、拉帕替尼、帕妥珠單抗）的出現(xiàn)，使得精準(zhǔn)篩選HER2陽性的胃癌患者顯得更為至關(guān)重要。

HER2在正常情況下處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到體內(nèi)外某些因素作用后被激活，具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10-11]。HER2基因擴增及過表達與胃癌患者不良預(yù)后呈相關(guān)性，與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)[12-13]。目前，HER2的檢測方法主要為對腫瘤組織樣本進行基因擴增檢測的熒光原位雜交(flurescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和檢測蛋白過表達的免疫組化染色(immuno-histochemistry，IHC)兩種。胃癌中HER2陽性率報道從6%～35%不等[14-16]，造成這種結(jié)果的原因可能有種族不同，樣本量過小，非標(biāo)準(zhǔn)化實驗的使用等因素。還可能因為FISH和IHC法檢測HER2為定性檢查，檢測者主觀判定不一，而且從獲取腫瘤組織到判讀的整個流程繁瑣，影響HER2檢測結(jié)果的因素非常多，稍有疏漏都有可能影響最終的結(jié)果。

更為重要的是，IHC 和FISH法取材困難，研究發(fā)現(xiàn)，檢測血清ctDNA可以實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤基因組信息,被稱為“液體活檢”。ctDNA是雙鏈DNA片段,主要來源于凋亡或壞死的腫瘤細胞，增殖活躍的腫瘤細胞能主動釋放DNA片段到外周循環(huán)中[17]。研究證實腫瘤患者ctDNA所攜帶的腫瘤基因組信息與腫瘤組織具有良好的一致性，能克服常規(guī)腫瘤組織活檢所無法突破的腫瘤異質(zhì)性問題[18]。通過對外周循環(huán)樣本進行ctDNA檢測，能協(xié)助早期診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷，也有助于靶向治療適應(yīng)癥的評估，從而推進精準(zhǔn)醫(yī)療的實施。

微滴數(shù)字PCR是ctDNA突變定量檢測的優(yōu)選檢測手段，可通過單分子擴增實現(xiàn)核酸拷貝數(shù)絕對定量，是一種高靈敏度的PCR定量檢測技術(shù)[19]，目前已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等方面，如拷貝數(shù)變異、突變檢測、單細胞基因表達分析等，并且在癌癥分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、傳染病研究、基因組結(jié)構(gòu)變異分析、基因表達分析等領(lǐng)域展現(xiàn)了強大的優(yōu)勢。本研究采用ddPCR技術(shù)，檢測胃癌患者血清ctDNA中HER2基因擴增表達水平。發(fā)現(xiàn)本組患者ddPCR的基因擴增與ICH的符合率為96%(96/100)，證實外周血ctDNA基因信息與腫瘤組織一致。同時，HER2陽性組預(yù)后不良率顯著高于HER2陰性組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明ctDNA中HER2與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)。

總體而言，微滴數(shù)字PCR檢測ctDNA中HER2表達，能夠提供實時的腫瘤負荷進展監(jiān)測，對腫瘤診斷、療效評估、預(yù)后預(yù)測和靶向藥物篩查均具有一定價值。