錢(qián)鐳，劉婷，辛雪，姜濤，胡淑敏，屈巖峰，任德財(cái)，*

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150066；2.黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司，黑龍江哈爾濱150086）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.or roselle）是錦葵科木槿屬的一種藥用草本植物，一年生，別名：洛神花、山茄子等，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前在我國(guó)許多地區(qū)如：廣東、臺(tái)灣、云南、海南等地均有大規(guī)模栽培[1]。玫瑰茄的花萼中富含天然色素花色苷，主要是飛燕草素和矢車(chē)菊素結(jié)合不同糖苷的物質(zhì)。花色苷是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，既可以食用、泡茶，又具有良好的保健功能和藥用價(jià)值，它有清除自由基、抗氧化的優(yōu)點(diǎn)，在抗癌、抗炎，預(yù)防老年癡呆和心血管疾病上有明顯作用[2]。隨著科技的發(fā)展，天然色素已慢慢取代了人工合成色素的市場(chǎng)[3]，廣泛應(yīng)用于飲料、酸奶和糖果等行業(yè)[4-5]，對(duì)天然色素的提取方法也在不斷優(yōu)化和更新，常見(jiàn)方法包括：溶劑浸提法、超臨界流體萃取法、微波輔助法等[6-7]。本文采取傳統(tǒng)的溶劑浸提法，對(duì)玫瑰茄干花萼中花色苷進(jìn)行提取，根據(jù)“相似相溶”原理，花色苷溶于甲醇、乙醇、丙醇等溶劑，考慮到甲醇具有毒性，故選擇乙醇為提取溶劑[8]。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)四因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)，探索最佳的提取工藝條件，為今后玫瑰茄中花色苷的分離、純化提供理論參考[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄干花萼：亳州；無(wú)水乙醇、三水合醋酸鈉、氯化鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SH11YX/UV-8000S紫外-分光光度計(jì)：上海陵光技術(shù)有限公司；LD5-2B高效離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將玫瑰茄干花萼粉碎成玫瑰茄粉，過(guò)70目標(biāo)準(zhǔn)篩，在干燥、密閉條件下儲(chǔ)存、備用。

1.3.2 玫瑰茄花色苷的提取

稱(chēng)取玫瑰茄粉2 g，按一定的料液比加入乙醇溶劑，于恒溫水浴鍋中浸提一定時(shí)間。冷卻后以5 000 r/min的速度離心10 min，取上清液備用[10]。

1.3.3 玫瑰茄花色苷波長(zhǎng)的測(cè)定

花色苷類(lèi)物質(zhì)的特征吸收值大約在278 nm和507 nm～536 nm區(qū)間內(nèi)[11]。為方便操作，將花色苷提取液稀釋一定體積，選取在可見(jiàn)光區(qū)505 nm～535 nm進(jìn)行掃描，繪制光譜圖，確定出玫瑰茄花色苷的最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.4 玫瑰茄花色苷含量的測(cè)定

根據(jù)馮建光等的研究方法[12]（過(guò)程稍作改動(dòng)），將提取液定容后取1.0mL，分別用氯化鉀緩沖液（0.025mol/L，pH1.0）和醋酸鈉緩沖液（0.4 mol/L，pH4.5）定容至 25 mL的棕色容量瓶中[13]，靜置90 min，以蒸餾水作空白，分別測(cè)定溶液在520 nm和700 nm處的吸光度（A），用pH示差法計(jì)算玫瑰茄中花色苷的含量，公式如下：

式 中 ：ΔA=（A520pH1.0-A700pH1.0）-（A520pH4.5-A700pH4.5）；DV 為定容的體積，mL；VF 為稀釋倍數(shù)；W 為樣品質(zhì)量，g；M為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量，449.2 g/moL；ε為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L為比色皿寬度，1 cm。

1.4 玫瑰茄花色苷提取工藝的研究

1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1.1 乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響

稱(chēng)取 5份玫瑰茄干粉（每份2 g），按料液比1∶25（g/mL），分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶劑，在60℃下提取60 min。

1.4.1.2 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響

稱(chēng)取 5份玫瑰茄干粉（每份2 g），按料液比1∶25（g/mL），加入濃度為40%的乙醇溶劑，分別在溫度為 40、50、60、70、80 ℃的條件下提取 60 min。

1.4.1.3 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

稱(chēng)取 5份玫瑰茄干粉（每份2 g），按料液比1∶25（g/mL），加入濃度為40%的乙醇溶劑，在 60℃下分別提取 30、60、90、120、150 min。

1.4.1.4 料液比對(duì)含量的影響

稱(chēng)取5份玫瑰茄干粉（每份2 g），分別按料液比1∶15、1∶20、1 ∶25、1 ∶30、1∶35（g/mL），加入濃度為40%的乙醇溶劑，在60℃下提取60 min。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素為自變量，花色苷含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)玫瑰茄花色苷的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰茄花色苷波長(zhǎng)的確定

玫瑰茄花色苷紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 玫瑰茄花色苷紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.1 UV-visible spectra of anthocyanins in roselle

如圖1所示，對(duì)花色苷提取液在可見(jiàn)光區(qū)505 nm～535 nm進(jìn)行掃描，得到玫瑰茄花色苷的最佳測(cè)定波長(zhǎng)為520 nm。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響

乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the content of anthocyanins in roselle

由圖2分析可知，隨乙醇濃度不斷增大，花色苷含量先增加后減少。當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，花色苷含量最大為5.102 mg/g。由于花色苷物質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的極性，若乙醇濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致溶液極性弱，從而使提取率降低[15]。因此，玫瑰茄花色苷的最佳乙醇濃度條件為40%。

2.2.2 提取溫度對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響

提取溫度對(duì)花色苷含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the content of anthocyanins in roselle

由圖3分析可知，提取溫度在40℃～70℃范圍內(nèi)，花色苷含量隨著溫度升高而增大，當(dāng)溫度為70℃時(shí)花色苷含量達(dá)到最大值5.203 mg/g，若繼續(xù)升溫花色苷含量降低。這是由于升溫雖有助于花色苷的溶出，但過(guò)高的溫度也會(huì)加快花色苷的降解，從而使總花色苷含量減少[16]。同時(shí)，乙醇在高溫下易揮發(fā)，也是花色苷含量減少的原因之一。

2.2.3 料液比對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響

料液比對(duì)花色苷含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)花色苷含量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the content of anthocyanins in roselle

由圖4分析可知，料液比大，花色苷提取不充分，溶液體積增大有利于花色苷的溶出，但過(guò)大比會(huì)稀釋提取濃度，使花色苷含量降低，也會(huì)造成提取溶劑的浪費(fèi)。因此，確定最佳料液比為1∶25（g/mL），此時(shí)花色苷含量為5.125 mg/g。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響

提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the content of anthocyanins in roselle

由圖5分析可知，隨提取時(shí)間的增加，花色苷含量先增大后減小，在90 min時(shí)花色苷含量為5.212 mg/g。90 min后花色苷含量下降，這是由于在長(zhǎng)時(shí)間保溫狀態(tài)下，花色苷結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化或遭到破壞[17]，故選擇最佳的提取時(shí)間為90 min。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化花色苷提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)出四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，其中24個(gè)析因點(diǎn)分別構(gòu)成三維頂點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)[18]。因素水平編碼表見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

使用Design Expert 8.0.6軟件，以乙醇濃度A、提取溫度B、提取時(shí)間C、料液比D為自變量，玫瑰茄花色苷含量Y為響應(yīng)值，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到方差分析表3，對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，建立一個(gè)回歸方程：

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding table of response surface methodology

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and results

Y=5.28-0.026A-0.021B-0.000 667C+0.007 33D+0.053AB-0.060AC+0.038AD+0.13BC-0.027BD-0.020CD-0.11A2-0.067B2-0.16C2-0.13D2

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

由表3可看出，響應(yīng)面回歸模型表現(xiàn)為極顯著（P＜0.000 1），有90%的數(shù)據(jù)可以被方程很好的解釋?zhuān)f(shuō)明該模型有良好的擬合性。4個(gè)因素對(duì)Y值（花色苷含量）的影響大小依次為：乙醇濃度（A）＞提取溫度（B）＞提取時(shí)間（D）＞料液比（C）。其中 C2、D2對(duì)Y值影響極顯著（P＜0.000 1），BC、A2、B2對(duì) Y 值影響顯著（P＜0.01），與回歸模型預(yù)測(cè)吻合[19]。該模型中C.V.%為1.08且失擬項(xiàng)顯著，說(shuō)明模型可較好的反映響應(yīng)值，試驗(yàn)操作可信度高。

2.3.3 各因素及其交互作用對(duì)花色苷含量的影響

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件得到各因素間的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面如圖6～圖11，進(jìn)一步分析其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。若等高線(xiàn)形狀為圓形，表示交互作用不顯著；若形狀為橢圓，表示交互作用顯著。響應(yīng)曲面越陡峭，表示響應(yīng)值對(duì)因素變化的適應(yīng)性越差[20]。

圖6～圖11可直觀(guān)表示出每?jī)蓚€(gè)因素間交互作用對(duì)花色苷含量的影響程度。AC、BC的交互作用顯著。其中BC的等高線(xiàn)更接近橢圓，對(duì)花色苷含量的影響更加明顯，這與方差分析的結(jié)論相一致。由響應(yīng)曲面觀(guān)察可知，AC、AD、BC、CD的曲面坡度較為陡峭，則其因素間交互作用對(duì)花色苷含量的影響較大，而AB、BD的響應(yīng)曲面坡度較為平緩，說(shuō)明其對(duì)花色苷含量影響較小。

圖6 乙醇濃度與提取溫度交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面Fig.6 Contour diagram and response surface of interaction between ethanol concentration and extraction temperature

圖7 乙醇濃度與料液比交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面Fig.7 Contour diagram and response surface of interaction between ethanol concentration and liquid ratio

圖8 乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面Fig.8 Contour diagram and response surface of interaction between ethanol concentrationand extraction time

圖9 料液比與提取溫度交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面Fig.9 Contour diagram and response surface of interaction between liquid ratio and extraction temperature

圖10 提取溫度與提取時(shí)間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面Fig.10 Contour diagram and response surface of interaction between extraction temperature and extraction time

圖11 料液比與提取時(shí)間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面Fig.11 Contour diagram and response surface of interaction between liquid ratio and extraction time

2.3.4 提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)回歸模型分析得出玫瑰茄花色苷提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度38.4%，提取溫度66.6℃，料液比1∶24.45（g/mL），提取時(shí)間91.5 min?；ㄉ绽碚撝禐?.288 mg/g。考慮到實(shí)際操作的方便性，最終以乙醇濃度38%，提取溫度66.6℃，料液比1∶24（g/mL），提取時(shí)間91 min為最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)測(cè)得花色苷含量為5.285 mg/g，結(jié)果與理論值較接近，說(shuō)明用該方法優(yōu)化花色苷提取條件有較高的可靠性和可行性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采取溶劑法提取玫瑰茄中花色苷，并用pH示差法計(jì)算花色苷含量。在乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)，對(duì)玫瑰茄中花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。各因素對(duì)提取效果的影響依次為：乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：乙醇濃度38%，提取溫度66.6℃，料液比1∶24（g/mL），提取時(shí)間91 min，該條件下提取液中花色苷含量為5.285 mg/g。此方法科學(xué)合理，花色苷的提取效率較高，可為今后的研究和實(shí)踐提供理論依據(jù)。