田夢(mèng)南,周秀秀,周欣,王志花,靳素榮
(武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢430070)
魔芋(konjac),學(xué)名“蒟蒻”,又稱(chēng)為蛇頭草、花桿蓮、鬼芋子等,是多年生天南星科屬草本植物。它既是一種功能性的蔬菜[1],又是功能性的藥膳食品[2-3],具有降低血脂和血糖[4]、清除氧自由基[5-6]、抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[7]、治療心血管疾病等作用[8-9]。魔芋中含有多種活性成分,其中黃酮(flavones)種類(lèi)眾多,功能不盡相同,其活性成分可以改善血液循環(huán),降低膽固醇等,已被用于心血管疾病方面的臨床治療[10]。此外魔芋中還含有揮發(fā)油成分,具有抑菌、消炎、抗腫瘤、殺蟲(chóng)、驅(qū)蟲(chóng)等生物活性,可用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、保健、農(nóng)林預(yù)防等方面[11-13]。目前,對(duì)植物中黃酮和揮發(fā)油成分的研究已相當(dāng)深入,但對(duì)魔芋成分的研究仍不系統(tǒng),不完善。
本文采用甲醇-超聲輔助提取法提取魔芋中黃酮類(lèi)化合物,結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法[14],優(yōu)化黃酮類(lèi)化合物的提取工藝,探索最佳的提取工藝條件。通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術(shù)[15]鑒定魔芋中揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對(duì)含量,比較不同魔芋樣品中揮發(fā)油成分的差異性。這為魔芋的分離和應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)以及理論參考。
紅魔芋和金珠2號(hào),采自湖北恩施。魔芋塊莖洗凈后分別將皮和肉切片分離,經(jīng)干燥、粉碎,過(guò)40目分樣篩,收集魔芋皮和魔芋粉,備用。
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙醚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硝酸鋁(分析純):上海新寶精細(xì)化工廠。
PS-D40A超聲波清洗機(jī):昆山市超聲儀器有限公司;FA2004B電子天平(d=0.1 mg):上海越平科學(xué)儀器有限公司;手動(dòng)移液器:艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司;UV5800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海元析儀器有限公司;TD6M臺(tái)式多管低速離心機(jī):長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;QP2010plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:島津有限公司。
1.3.1 魔芋中黃酮類(lèi)化合物的提取
精確稱(chēng)取魔芋樣品1.0g(精度0.1mg),置于250mL錐形瓶中,料液比1∶30(g/mL),甲醇濃度 70%,40℃下超聲提取3次,每次30 min。離心,濾膜抽濾并合并濾液,加壓濃縮,得黃酮類(lèi)化合物的提取液。
1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品3.0mg(精度0.1mg),用70%甲醇溶液定容至 25mL。依次移取 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)液,依次加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,反應(yīng)10 min。再依次加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液,搖勻,反應(yīng)10 min。再依次加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液和0.4 mL蒸餾水,搖勻,70%甲醇溶液定容至25 mL。放置10 min,510 nm處分別測(cè)定不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度。以濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。線性擬合得線性回歸方程為:A=9.24C+2.87×104,R2=0.999 7。
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin
1.3.3 魔芋中黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定
式中:n為稀釋倍數(shù);c為測(cè)定的黃酮類(lèi)化合物濃度,mg/mL;m為魔芋粉的質(zhì)量,g;ω為魔芋中黃酮類(lèi)化合物的提取量,mg/g。
1.3.4 單因素試驗(yàn)
以黃酮類(lèi)化合物提取量為優(yōu)化指標(biāo),選取甲醇濃度50%、60%、70%、80%、90%,料液比 1∶20、1∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50(g/mL),超聲時(shí)間 20、25、30、35、40、50 min,超聲溫度 30、35、40、45、50、55、60 ℃,提取級(jí)數(shù)1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)、5級(jí)5個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),考察各因素對(duì)魔芋黃酮類(lèi)化合物提取量的影響。
1.3.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃酮類(lèi)化合物的提取工藝
根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,確定響應(yīng)曲面法的自變量影響因素為超聲時(shí)間、超聲溫度、甲醇濃度和料液比。以黃酮提取量為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)曲面分析,因素水平見(jiàn)表1。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和數(shù)值水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnke experiments
在Design-Expert 8.0軟件中,根據(jù)n中心組合原理,確定了29組有效的試驗(yàn)條件,其中有25組是中心試驗(yàn),4組是重復(fù)試驗(yàn)條Box-Benhnke件,用于評(píng)估試驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。
1.3.6 驗(yàn)證數(shù)學(xué)模型并檢驗(yàn)提取工藝的穩(wěn)定性
在最佳工藝條件下平行提取6次,測(cè)定魔芋中黃酮類(lèi)化合物的含量,考查數(shù)學(xué)模型建立的是否合理和工藝條件的重復(fù)性是否良好。
1.3.7 魔芋中黃酮類(lèi)化合物的含量分析
選取金珠2號(hào)和紅魔芋兩個(gè)魔芋品種為研究對(duì)象,最佳工藝條件下分別測(cè)定金珠2號(hào)(粉和皮)和紅魔芋(粉和皮)4個(gè)樣品中黃酮類(lèi)化合物的含量,分析品種及組織間含量的差異性。
1.3.8 魔芋中揮發(fā)油成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析
準(zhǔn)確稱(chēng)取金珠2號(hào)(粉和皮)和紅魔芋(粉和皮)1.0 g(精度0.1 mg)分別置于4個(gè)250 mL錐形瓶中,料液比為1∶40(g/mL)的甲醇溶液,40℃下超聲提取3次,超聲時(shí)間 30 min[16],合并濾液,低速離心,0.22 μm濾膜抽濾,收集濾液,加壓濃縮,得黃褐色揮發(fā)油浸膏。8 mL乙醚萃取分離,高速離心,收集上清液,進(jìn)行GCMS分析。
色譜條件:DB-5石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm);FID 檢測(cè)器;進(jìn)樣溫度 250℃;載氣為 He;流速為1 mL/min;升溫設(shè)置為保持50℃,3 min后以6℃/min的速率勻速升至90℃,保持1min后以8℃/min的速率勻速升至220℃,保持2 min后以8℃/min的速率勻速升至250℃,繼續(xù)保持2 min;進(jìn)樣模式為不分流;進(jìn)樣量 0.5 μL。
質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;離子源溫度250℃;電子能量70 eV;質(zhì)量范圍40 amu~600 amu。
2.1.1 甲醇濃度對(duì)魔芋中黃酮提取量的影響
以黃酮類(lèi)化合物提取量為優(yōu)化指標(biāo),選取甲醇濃度 50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行單因素試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
圖2 提取劑濃度對(duì)黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction content
由圖2可知,甲醇濃度由50%增加到80%時(shí),黃酮類(lèi)化合物的提取量會(huì)隨著提取劑濃度的增加而提高。當(dāng)80%達(dá)到最大值之后,黃酮類(lèi)化合物的提取量會(huì)隨甲醇濃度的增加而降低。因此,選擇80%甲醇溶液為最佳提取濃度。
2.1.2 料液比對(duì)魔芋中黃酮提取量的影響
以黃酮類(lèi)化合物提取量為優(yōu)化指標(biāo),選取料液比1 ∶20、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50(g/mL)進(jìn)行單因素試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
圖3 料液比對(duì)黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on extraction content
由圖3可知,適當(dāng)增大料液比,可提高魔芋中黃酮類(lèi)化合物的提取量,料液比為1∶40(g/mL)時(shí),黃酮類(lèi)化合物的提取量最大,達(dá)到1.70 mg/g,料液比再增加,黃酮類(lèi)化合物的提取量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此,選擇1∶40(g/mL)為最佳料液比。
2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)魔芋中黃酮提取量的影響
以黃酮類(lèi)化合物提取量為優(yōu)化指標(biāo),選取超聲時(shí)間 20、25、30、35、40、50 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
圖4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction content
由圖4可知,超聲時(shí)間由20 min延長(zhǎng)到30 min時(shí),黃酮類(lèi)化合物的提取量會(huì)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。30 min時(shí)達(dá)到最大值,之后,黃酮類(lèi)化合物的提取量會(huì)隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。從工業(yè)角度來(lái)說(shuō),降低超聲時(shí)間可減少能量消耗。因此,選擇超聲30 min為最佳超聲時(shí)間。
2.1.4 超聲溫度對(duì)魔芋中黃酮提取量的影響
以黃酮類(lèi)化合物提取量為優(yōu)化指標(biāo),選取超聲溫度 30、35、40、45、50、55、60 ℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
圖5 超聲溫度對(duì)黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on extraction content
由圖5可知,黃酮類(lèi)化合物的提取量隨著超聲溫度的升高而增大,45℃時(shí)達(dá)到最大值,之后,黃酮類(lèi)化合物的提取量則隨著溫度的上升而下降。因此,選擇45℃為最佳超聲溫度。
2.1.5 提取級(jí)數(shù)對(duì)魔芋中黃酮提取量的影響
以黃酮類(lèi)化合物提取量為優(yōu)化指標(biāo),選取提取級(jí)數(shù)1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)、5級(jí)進(jìn)行單因素試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。
圖6 提取級(jí)數(shù)對(duì)黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of microwave number of times on extraction content
由圖6可知,提取級(jí)數(shù)增加黃酮類(lèi)化合物的提取量增大,當(dāng)提取級(jí)數(shù)大于3時(shí),黃酮類(lèi)化合物的提取量增幅明顯變緩??刂铺崛〖?jí)數(shù),可節(jié)省能源,增加經(jīng)濟(jì)效益。因此,選擇3級(jí)為最佳提取級(jí)數(shù)。
由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,最佳試驗(yàn)條件為80%甲醇溶液,料液比 1 ∶40(g/mL),超聲時(shí)間 30 min,超聲溫度45℃,提取級(jí)數(shù)3級(jí),魔芋中黃酮類(lèi)化合物的提取量為1.17 mg/g。
影響魔芋中黃酮類(lèi)化合物提取量的因素有很多個(gè),各影響因素間存在交互作用,因此,選用響應(yīng)曲面法優(yōu)化魔芋中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝條件,分析各影響因素的先后次序,確定最佳的提取工藝條件。
2.2.1 方差分析
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以黃酮類(lèi)化合物提取量為響應(yīng)值,確定超聲時(shí)間、超聲溫度、甲醇濃度和料液比4個(gè)自變量,根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理,通過(guò)Design-Expert軟件確定試驗(yàn),評(píng)估試驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差,結(jié)果如表2所示。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)表Table 2 Response table of Box-Benhnken experiments
由表2可知,在響應(yīng)面試驗(yàn)中,當(dāng)超聲時(shí)間30min、超聲溫度40℃、甲醇濃度80%、料液比1∶35(g/mL),魔芋中黃酮類(lèi)化合物的提取量最大,為1.48 mg/g。該條件不同于單因素最佳試驗(yàn)條件,黃酮類(lèi)化合物提取量高于單因素試驗(yàn)結(jié)果。
利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,考查各因素的交互作用和影響提取率的先后次序,如表3。
表3 響應(yīng)方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Benhnken experiments
由表 3 可得,B、C、B×D、B2、C2對(duì)魔芋中黃酮類(lèi)化合物提取量的影響極其顯著(P < 0.01);D、B×C、C×D對(duì)魔芋中黃酮類(lèi)化合物提取量的影響顯著(0.01<P<0.05);其他因素對(duì)魔芋中黃酮類(lèi)化合物提取量的影響不顯著。通過(guò)比較F值的大小,判定各因素影響的先后次序?yàn)椋杭状紳舛龋–)>超聲溫度(B)>料液比(D)>超聲時(shí)間(A)。該模型較好的反映了魔芋中黃酮類(lèi)化合物提取時(shí)各因素之間具有交互作用。
2.2.2 優(yōu)化提取工藝參數(shù)
以黃酮類(lèi)化合物提取量為響應(yīng)值,Design-Expert 8.0軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,建立響應(yīng)面優(yōu)化的數(shù)學(xué)模型,通過(guò)計(jì)算數(shù)學(xué)模型的最優(yōu)解獲得黃酮的最佳提取工藝條件。響應(yīng)曲面如圖7~圖9所示。
圖7 超聲溫度和料液比交互作用的等高線圖及三維圖Fig.7 Contour chart and 3D chart about interaction of temperature and solid-liquid ratio
圖8 超聲溫度和甲醇濃度交互作用的等高線圖及三維圖Fig.8 Contour chart and 3D chart about interaction of temperature and methanol concentration
圖9 甲醇濃度和料液比交互作用的等高線圖及三維圖Fig.9 Contour chart and 3D chart about interaction of methanol concentration and solid-liquid ratio
由響應(yīng)三維圖7b、圖8b、圖9b可知,曲面表面彎曲程度不同,說(shuō)明超聲溫度和料液比、超聲溫度和甲醇濃度、甲醇濃度和料液比存在交互作用,各因素對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取量的影響不同,交互作用的先后次序?yàn)椋˙×C)>(C×D)>(B×D)。由響應(yīng)等高線圖 7a、圖8a、圖9a可知,在所選的試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi),存在極值,該極值在響應(yīng)曲面的中心點(diǎn)附近。
Design-Expert 8.0軟件根據(jù)響應(yīng)曲面建立了超聲時(shí)間(A)、超聲溫度(B)、甲醇濃度(C)和料液比(D)4個(gè)因素的二階響應(yīng)模型,數(shù)學(xué)模型如下:
在多元回歸方程中P=0.0004,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.001,說(shuō)明自變量因素對(duì)魔芋中總黃酮提取量的影響十分顯著,且回歸方程中多元相關(guān)系數(shù)R2=0.986 7,CV=10.61%,說(shuō)明響應(yīng)值中98.67%的結(jié)果均由模型中的自變量因素產(chǎn)生,與實(shí)際試驗(yàn)的相關(guān)度極高(>95%),試驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差較小。由數(shù)學(xué)模型得到最佳的提取工藝條件為:超聲時(shí)間35 min,超聲溫度40℃,甲醇濃度88%,料液比1∶32(g/mL),黃酮類(lèi)化合物的預(yù)測(cè)提取量為 1.84 mg/g,誤差±0.272。
2.2.3 檢驗(yàn)提取工藝的穩(wěn)定性并驗(yàn)證數(shù)學(xué)模型的合理性
根據(jù)數(shù)學(xué)模型的最佳提取工藝條件,同時(shí)為了增加實(shí)際的可操作性,分析6組平行試驗(yàn)結(jié)果(如圖10),考查最佳工藝的穩(wěn)定性;對(duì)比模型預(yù)測(cè)的結(jié)果與實(shí)際值的差距,考查模型建立的合理性。
重復(fù)測(cè)定6組平行試驗(yàn)并計(jì)算黃酮的含量,試驗(yàn)結(jié)果依次為 1.76、1.74、1.72、1.77、1.69、1.76 mg/g。由圖10直觀的反映出6組試驗(yàn)值十分接近,平均偏差為0.028,相對(duì)平均偏差為2.37%,說(shuō)明該工藝條件的穩(wěn)定性較好,準(zhǔn)確度較高。
在此工藝條件下,黃酮類(lèi)化合物提取量的平均值為1.73 mg/g,數(shù)學(xué)模型的計(jì)算值是1.84 mg/g,相差-0.11 mg/g,在模型允許的誤差范圍內(nèi),說(shuō)明該模型建立合理。該試驗(yàn)結(jié)果高于單因素試驗(yàn)結(jié)果(1.17 mg/g)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(1.48 mg/g),相比單因素試驗(yàn)結(jié)果,優(yōu)化后的提取工藝條件將黃酮的提取量提高了47.9%,說(shuō)明該模型確定的最佳工藝條件達(dá)到了優(yōu)化的目的,提高了黃酮類(lèi)化合物的提取量。因此,通過(guò)響應(yīng)曲面法建立數(shù)學(xué)模型,實(shí)現(xiàn)了優(yōu)化提取工藝條件的目的。
2.2.4 魔芋樣品中黃酮類(lèi)化合物的含量分析
數(shù)學(xué)模型確定的最佳工藝條件下分別提取金珠2號(hào)(粉和皮)和紅魔芋(粉和皮)中黃酮類(lèi)化合物,計(jì)算黃酮的提取量見(jiàn)表4。
表4 魔芋樣品中黃酮類(lèi)化合物的含量Table 4 Content of flavone in jinzhu NO.2 and red konjac
由表4可得,紅魔芋中黃酮類(lèi)化合物的含量高于金珠2號(hào)中黃酮類(lèi)化合物的含量;魔芋皮中黃酮類(lèi)化合物的含量高于魔芋粉中黃酮類(lèi)化合物的含量,且皮中黃酮類(lèi)化合物的含量是粉中的1.3倍~1.5倍。因此,魔芋樣品和組織間的黃酮類(lèi)化合物在含量上存在差異性,為魔芋的遺傳育種提供參考依據(jù)。
2.2.5 魔芋中揮發(fā)油成分的分析
采用甲醇-超聲輔助提取法提取金珠2號(hào)(粉和皮)和紅魔芋(粉和皮)揮發(fā)油成分,用乙醚萃取分離后,進(jìn)行GC-MS鑒定分析,評(píng)價(jià)不同魔芋樣品中揮發(fā)油成分在化學(xué)組成和相對(duì)含量上的差異性。通過(guò)揮發(fā)油的總離子流圖檢索得揮發(fā)油成分見(jiàn)表5。
表5 魔芋中揮發(fā)油成分測(cè)定結(jié)果Table 5 The determination results of the components of volatile oil from jinzhu NO.2 and red konjac
由表5可知,采用甲醇-超聲輔助提取法依次提取金珠2號(hào)和紅魔芋中揮發(fā)油成分,乙醚萃取分離,GC-MS技術(shù)鑒定其化學(xué)組成,共鑒定28種有效成分,其中6種醇類(lèi)化合物,12種烷烴類(lèi)化合物,5種酮類(lèi)化合物,1種胺類(lèi)化合物,1種酯類(lèi)化合物,1種醛類(lèi)化合物,其它化合物2種。金珠2號(hào)粉和皮中分別鑒定出16種和19種揮發(fā)油成分,紅魔芋粉和皮分別鑒定出20種揮發(fā)油成分,其中11種相同的揮發(fā)油成分。說(shuō)明不同的魔芋品種中揮發(fā)油成分存在差異性,為魔芋的分類(lèi)利用和遺傳育種提供試驗(yàn)支撐。
對(duì)金珠2號(hào)和紅魔芋中揮發(fā)油成分提取分離,發(fā)現(xiàn)不同的魔芋品種中揮發(fā)油在組成和含量上均存在差異性,該研究拓寬了魔芋的利用途徑,根據(jù)不同魔芋品種中揮發(fā)油成分的不同進(jìn)行分類(lèi)利用,對(duì)魔芋的遺傳育種提供有力的參考價(jià)值。
采用超聲輔助提取法提取魔芋中黃酮類(lèi)化合物,結(jié)合單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面法確定各因素影響黃酮類(lèi)化合物提取量的先后次序?yàn)椋杭状紳舛龋境暅囟龋玖弦罕龋境晻r(shí)間,最佳工藝條件為:超聲時(shí)間35 min,超聲溫度40℃,甲醇濃度88%,料液比1∶32(g/mL)。在此條件下,黃酮類(lèi)化合物的提取量為1.73 mg/g,比單因素試驗(yàn)提高了近47.9%。最佳條件下測(cè)定金珠2號(hào)(粉和皮)和紅魔芋(粉和皮)中黃酮類(lèi)化合物的含量可知,不同魔芋品種和組織中黃酮類(lèi)化合物的含量存在差異性。采用甲醇-超聲輔助提取法提取金珠2號(hào)(粉和皮)和紅魔芋(粉和皮)中揮發(fā)油成分,GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析其化學(xué)成分,得出不同的魔芋品種及組織間的揮發(fā)油成分存在差異性。
人們生活水平日漸提高,功能保健品的需求日益增大,魔芋及其產(chǎn)品得到廣泛關(guān)注,魔芋中化學(xué)成分復(fù)雜,性質(zhì)各異,應(yīng)用廣泛。本論文以魔芋為研究對(duì)象,系統(tǒng)地研究其主要化學(xué)成分(黃酮、揮發(fā)油),采用現(xiàn)代分析技術(shù)和手段分析魔芋重要活性成分的含量差異,為全面了解魔芋化學(xué)組成及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。