（呼倫貝爾職業(yè)技術學院，內蒙古呼倫貝爾021000）

我國牛肉醬的品種繁多，但調配型肉醬居多[1-3]，口味不夠醇厚，未經(jīng)完全水解的牛肉成分也不能完全被人體吸收，造成資源的浪費。發(fā)酵型牛肉醬是以豆粕、炒小麥、面粉、香菇粉和牛肉為原料，以低鹽固態(tài)醬油發(fā)酵工藝釀造。但發(fā)酵中的米曲霉[4-6]并不能充分利用動物蛋白，不利于生成人體易于吸收的氨基酸和小分子肽類，風味物質的形成也受到了限制。

因此，以復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶分別對牛肉進行預處理，在此基礎上考察不同蛋白酶制劑對牛肉酶解效果的影響，篩選出適宜蛋白酶。這將為發(fā)酵型牛肉醬的風味形成和營養(yǎng)吸收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

復合蛋白酶（酶活力：2.7×105U/g）、木瓜蛋白酶（2×105U/g）、胰蛋白酶（3.1×105U/g）、風味蛋白酶（0.4×105U/g）：天津春發(fā)香精有限公司；生牛肉：超市統(tǒng)一購買。

色譜級甘氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸（分子量：451 Da）、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（分子量：189 Da）：美國Sigma公司；色譜級細胞色素C、抑菌肽和維生素B12：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A型高效液相色譜分析儀：日本島津公司；PHSJ-4A型pH計：上海滬粵明科學儀器有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計：上海美析儀器有限公司。

1.3 牛肉酶解

將牛肉打碎后與水按質量比1∶1混勻，根據(jù)表1給出的條件以復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶分別對牛肉進行酶解，酶解過程中進行恒溫攪拌操作，各樣品均水解3 h。其中復合蛋白酶是桿菌蛋白酶復合體，主酶是堿性蛋白酶，酶活力根據(jù)主酶活力定義。

表1 4種蛋白酶酶解的條件Table 1 Four kinds of protease digestion conditions

1.4 牛肉酶解液理化指標的測定

取10 mL酶解的上清液定容至50 mL，得到10%的稀釋液?？偹岷堪凑誈B/T 12456-2008《食品中總酸的測定》進行測定；氨基酸態(tài)氮含量按照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》進行測定；可溶性氮含量按照凱氏定氮法進行測定。

1.4.1 酶解液pH值的測定

過濾酶解液，使用pH計直接測定其pH值。

1.4.2 酶解液蛋白利用率、肽得率和水解度的測定

蛋白利用率：測定酶解液的上清液和牛肉的總氮量，按下列公式計算：

肽得率：測定酶解上清液中的總氮和氨基態(tài)氮含量，則肽得率的公式如下：

水解度（degree of hydrolysis，DH）：是國際上測量蛋白水解效果的重要指標之一，指水解過程中斷裂的肽鍵數(shù)目占總肽鍵數(shù)目的比例[7]。水解斷裂的肽鍵數(shù)可通過甲醛滴定法測定水解釋放出的氨基態(tài)氮的數(shù)目，水解度的計算公式如下：

1.4.3 酶解液中小分子肽分子量分布測定

樣品預處理：蛋白酶解上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用島津高效液相色譜儀對樣品處理液組分進行測定。

色譜條件：色譜柱：Shodex protein KW802.5；檢測波長：220 nm；進樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min；流動相：50 mmol/L 磷酸緩沖液和 0.3 mol/L NaCl（pH=7.0）。

標準品：細胞色素 C（分子量：12 500 Da）、抑菌酶（分子量：6 500 Da）、維生素B12（分子量：14 355 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量：451 Da）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量：189 Da）。以標準蛋白質的相對分子質量的對數(shù)（Y）為縱坐標，出峰時間（X）為橫坐標的相對分子質量標準曲線。線性回歸方程為：

游離氨基酸的定性定量方法：根據(jù)各個標準品出峰時間進行定性。以樣品中的峰面積外標法進行定量分析。

1.4.4 酶解液中游離氨基酸的測定

溶液的衍生：取樣品和標準品溶液各200 μL，加入 100 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯脂乙腈溶液、100 μL 1.0 mol/L三乙胺乙腈溶液，搖勻，在通風櫥內放置1 h，加入400 μL正己烷，搖勻，靜置10 min，去除上層液體，下層溶液0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣20 μL。

色譜柱：Aminex HPx-87H Ino Exclusion Column（300 mm×7.8 mm）。色譜條件：檢測波長254 nm，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL。標準品是由不同含量的18種氨基酸混合制成，表2是18種氨基酸標品的含量。

續(xù)表2 18種混合標準氨基酸的含量Continue table 2 The content of 18 kinds of amino acids mixture standard

1.4.5 酶解液中鮮味和苦味測定

感官評定的標準溶液配制：苦味：1.2×10-5mol/L奎寧溶液；鮮味：2×10-2mol/L谷氨酸鈉溶液。

以含2%樣品蛋白的溶液作為品嘗對象。評定開始前對10位人員進行專業(yè)培訓，并且確定本試驗的感官評定的標準和注意事項。評定成員單獨對樣品進行評定，成員之間不進行交流，在評定前和樣品之間用清水漱口。采用5分制，評分方法如下：1-無，2－弱，3－一般，4－較強，5－強，分別對樣品打分，評價小組打分的平均值作為各個樣品的最終分值。

2 結果與討論

2.1 pH值和總酸含量的測定

本試驗選用復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶，分別研究這4種蛋白酶制劑的添加對酶解液pH值和總酸的影響，結果見圖1、圖2。

圖1 酶解液的pH值Fig.1 The pH of the enzymatic hydrolysate

圖2 酶解液的總酸含量Fig.2 The total acids of the enzymatic hydrolysate

不同蛋白酶解液pH值和總酸含量變化與牛肉蛋白水解后形成含羰基端的多肽物質和氨基酸有很大的關系。蛋白水解過程是蛋白質在蛋白酶的作用下生成小分子多肽和氨基酸的過程。在此過程中，隨著水解的不斷進行，水解液中多肽和氨基酸也不斷生成，水解液的pH值和總酸含量也跟著發(fā)生變化。

由圖1、2可知，各酶解液的pH值與空白組差別不大，都在6.6左右，添加蛋白酶的水解的總酸含量比空白組顯著性高，其中添加復合蛋白酶的酶解液的總酸含量最高，達到約0.5 g/100 g，添加風味蛋白酶的酶解液的總酸含量最低。

2.2 氨基酸態(tài)氮和可溶性氮含量的測定

隨著蛋白酶解過程的進行，部分不可溶性蛋白水解成可溶性的多肽和氨基酸，使得酶解液中的氨基酸態(tài)氮和可溶性氮含量不斷增加，所以氨基酸態(tài)氮和可溶性氮含量是評價蛋白酶水解效果的重要指標[8-11]，結果見圖3、圖4。

圖3 酶解液氨基酸態(tài)氮的含量Fig.3 The content of amino nitrogen of the enzymatic hydrolysate

由圖3、圖4可知，4種添加蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮和可溶性氮含量均高于空白組，而且各個蛋白酶的水解能力也不相同。其中復合蛋白酶的水解能力最高，氨基酸態(tài)氮含量高達0.168 g/100 g，可溶性氮含量為0.904 g/100 g，依次是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶。因此，僅從氨基酸態(tài)氮和可溶性氮含量來看，復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解牛肉蛋白的能力均較好。

圖4 各酶解液可溶性氮含量Fig.4 The content of soluble nitrogen of the enzymatic hydrolysate

2.3 酶解液的蛋白利用率、肽得率和水解度的測定

4種蛋白酶水解效果比較見圖5。

圖5 4種蛋白酶水解效果的比較Fig.5 Four kinds of proteinase hydrolysis effect comparison

由圖5可知，添加蛋白酶的組別的蛋白利用率、肽得率和水解度均高于空白組，說明蛋白酶能較好地水解蛋白。蛋白質利用率：復合蛋白酶的水解效果最好（28.99%），木瓜蛋白酶次之（25.58%），風味復合蛋白酶的水解產物的蛋白質利用率最低（13.64%）；肽得率：復合蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最好（23.60%和21.09%），風味蛋白酶的水解效果最差（10.50%）；水解度：復合蛋白酶水解產物最高（5.38%），風味蛋白酶水解產物的水解度最低（3.14%）。這表明各種酶由于酶作用位點的特異性，對同一底物牛肉蛋白具有不同的水解能力，而且添加復合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液的水解效果較好。

2.4 酶解液中小分子多肽分子量分布的測定

肽類分子量分布的研究方法最常用SDS-PAGE和高效液相凝膠色譜法，它們都是根據(jù)分子量大小對蛋白質以及多肽的分離純化，但SDS-PAGE分析的是蛋白質亞基的分子質量，而高效液相凝膠色譜則分析完整蛋白質的分子質量[12-14]。本試驗采用高效液相色譜法分析酶解液中小分子多肽分子量分布。結果見表3。

表3 各個酶解液蛋白相對分子量分布Table 3 The relative molecular weight distribution of the enzymolysis liquid protein

與空白組相比，在4個酶解產物中多肽的分子質量分布總體表現(xiàn)為，分子量較大的多肽占得比例較小，分子量小的多肽占得比例較大。所以這4種蛋白酶與空白組相比，均能不同程度地水解大分子蛋白質和多肽，但由于這4種蛋白酶作用基團的不同，這4種蛋白酶的水解產物中多肽分子量分布表現(xiàn)出一定的差異性。由表3可知，添加復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的酶解產物中相對分子質量大于5 000 Da的多肽的比例很少，分別為5.36%、6.39%、11.32%，添加風味蛋白酶的酶解液在此范圍內的多肽含量較高，占38.49%，這部分肽類由于分子量較大無法進入味蕾細胞，對食品呈味貢獻不大。由此可見，前3種酶均能較好地降解牛肉蛋白中相對分子質量大于5 000 Da的片段。小分子量的多肽對于肉香味的生成是極其重要的，分子量在2 000 Da～5 000 Da范圍內的多肽產生的肉香味強度最強，在此范圍的多肽以添加木瓜蛋白酶的含量最高。而在分子量小于1 000 Da的范圍內的多肽略有牛肉香氣、稍有苦味但可接受。分子量小于500 Da的小肽在人體中具有重要的生理功能，其分子量的大小對其生理功能具有重要影響。在此范圍的小分子多肽含量以復合蛋白酶最好，其次是木瓜蛋白酶。綜合比較4個酶解液中各個多肽分子量段分布，以添加復合蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解液較好。

2.5 酶解液中游離氨基酸含量的測定

由表4可以看出，游離氨基酸含量由高到低分別為復合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、空白。而與食品風味息息相關的氨基酸最主要就是鮮味和苦味氨基酸，4個發(fā)酵組中復合蛋白酶的鮮味氨基酸含量顯著高于其他組別，苦味氨基酸含量較其他組有所降低。由具體的組成可知，添加復合蛋白酶的酶解液的游離氨基酸較其他組別要好。

表4 4種不同酶制劑的添加對游離氨基酸含量的影響Table 4 Analysis of free amino in the four kinds of essential matrix g/mL

2.6 酶解液的感官評定

各個酶解液的感官評價值見圖6。

圖6 各個酶解液的感官評價值Fig.6 The sensory evaluation value of enzymolysis liquid

酶解產物呈現(xiàn)的味道對產品的質量和風味有著重要的影響，其中苦味是影響酶解產物呈味的重要因素，而鮮味也是其中的一個重要指標，并且這兩種味感相輔相成，相互影響，這兩種呈味與體系中氨基酸和多肽的含量有很大的關系。本文探索蛋白酶酶解產物的呈味和酶解產物中的成分關系，對酶解產物的應用起到有利的作用。由圖6可知，添加復合蛋白酶的酶解液的鮮味最高，其次是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶。在苦味方面，復合蛋白酶的感官評價分值最低，木瓜蛋白酶的最高。由酶解產物的感官評價可知，添加復合蛋白酶的酶解液在鮮味和苦味這兩種味感的評價較好，是酶解牛肉的最佳蛋白酶制劑。

3 結論

由于發(fā)酵菌種（米曲霉、乳酸菌等）對動物蛋白的利用率較低，通過添加蛋白酶制劑提高原料蛋白的利用率，選用復合蛋白酶[15]、木瓜蛋白酶[16]、胰蛋白酶[17]和風味蛋白酶[18]對牛肉進行水解，通過測定酶解液的理化指標、風味肽分子量分布、游離氨基酸含量等，選出最適宜的蛋白酶。

綜合酶解產物的各項指標測定結果，添加復合蛋白酶的酶解液在理化指標方面明顯優(yōu)于其他蛋白酶。在多肽分子量分布方面，分子量2 000 Da～5 000 Da肽段以木瓜蛋白酶的比例最高，達到62.06%，這一部分肽的含量對于肉味的生成是極其重要的，而且此范圍內的小肽產生的肉味強度最大；而分子量小于1 000 Da略有牛肉香氣、稍有苦味但可接受。分子量小于500 Da的多肽在人體中具有重要的生理功能，其分子量的大小對其生理功能具有重要影響。在此范圍的小肽含量以復合蛋白酶最好。在游離氨基酸方面，添加復合蛋白酶酶解液的氨基酸總量最多，其中鮮味氨基酸含量明顯高于其他組別，苦味氨基酸含量低于其他組別。綜合各項測定結果，復合蛋白酶是較適合酶解牛肉蛋白的酶制劑。

通過酶解技術開發(fā)醬香型牛肉醬提升了產品的營養(yǎng)價值和風味，可作為醬香醇厚型牛肉醬及其產品的研發(fā)的技術依據(jù)，還可為動物蛋白質加工深層次利用提供借鑒經(jīng)驗，滿足大眾日益增長的“天然、營養(yǎng)、健康、美味”飲食需求。