李世杰，李勇，曾海英

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

茯苓（Poria cocos），又名茯菟、萬靈桂、茯靈等[1]，是寄生于松科植物馬尾松或赤松等樹根上，擔(dān)子菌綱非褶菌目多孔菌科的一種，為藥食兩用真菌，主要功能成分為茯苓多糖，約占茯苓干重的84.2%[2]。茯苓多糖，分子結(jié)構(gòu)多為β-（1→3）-D-葡聚糖，含有少量β-（1→6）糖苷鍵側(cè)鏈，具有多重生物活性，如：抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝作用等[3-4]。在免疫調(diào)節(jié)方面，茯苓多糖對特異性和非特異性免疫功能均有促進(jìn)作用[5]。候瑋婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)灌胃復(fù)方茯苓多糖口服液，對小鼠實體瘤有顯著抑制作用且能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）活性。張秀軍等[7]通過體內(nèi)外給藥觀察小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用和巨噬細(xì)胞吞唾中性紅的能力，結(jié)果表明羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachymaran，CMP）可增強巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，體內(nèi)外均能顯著增強小鼠免疫功能。但茯苓多糖具有的分子量高、結(jié)構(gòu)緊密、水溶性差等特性，生物活性利用率不高[8]。林標(biāo)聲等[9]研究了高取代度羧甲基茯苓多糖的制備工藝及其免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)羧甲基茯苓多糖具有直接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞、增強巨噬細(xì)胞吞噬、調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用。武洪志等[10]研究黑曲菌發(fā)酵茯苓的工藝，發(fā)現(xiàn)經(jīng)黑曲發(fā)酵后茯苓中多糖的含量顯著增加。然而黑曲菌發(fā)酵茯苓在增加茯苓多糖含量的同時，是否能夠改變茯苓多糖結(jié)構(gòu)，從而改善其免疫調(diào)節(jié)作用，目前相關(guān)研究鮮有報道。研究以黑曲菌發(fā)酵后的茯苓多糖為原料，探究發(fā)酵茯苓多糖對免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用影響，為茯苓多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓：貴州省黎平縣；黑曲菌：貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室；昆明小鼠：重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，6周～8周齡，雌雄各半，無特定病原體（specific pathogen free，SPF），體重 18 g～22 g，實驗動物合格證號為：SCXK（軍）2012-0011；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）測定試劑盒：上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

智能生化培養(yǎng)箱（SHP-250型）：上海光都儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計（TU-1810型）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高速萬能粉碎機（FW100型）：天津市泰斯特儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機（TGL20M型）：長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；光吸收酶標(biāo)儀（Spectra Max 190）：美谷分子儀器（上海）有限公司；倒置相差顯微鏡（MoticAE31型）：麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵茯苓多糖制備

參照文獻(xiàn)發(fā)酵茯苓并提取茯苓多糖：取適量茯苓，在料水比 1 ∶0.93（g/mL），發(fā)酵時間 7.4 d，發(fā)酵溫度32℃，初始pH值為5.5，接種量為4%的條件下發(fā)酵，獲得發(fā)酵茯苓[10]。取適量發(fā)酵茯苓，按照1∶20（g/mL）的料液比加入蒸餾水，沸水浴1 h，趁熱抽取濾液，濃縮后加入4倍量的85%的乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，離心除去上清液，沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，冷凍干燥獲得發(fā)酵茯苓多糖樣品[11]。

1.3.2 免疫低下小鼠模型構(gòu)建

將已適應(yīng)生活1周的昆明小鼠隨機分為空白對照組（CK）、環(huán)磷酰胺模型組（cyclophosphamide，CY）、發(fā)酵茯苓多糖（fermented Poria cocos polysaccharides，F(xiàn)PCP）高劑量組、FPCP低劑量組4個組，每組小鼠10只。FPCP 高、低灌胃劑量分別為 100、50 mg/kg·BW。各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液，劑量為60 mg/kg·BW，連續(xù)注射3 d，構(gòu)建環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。CK組腹腔注射等劑量的生理鹽水。小鼠免疫功能低下模型建立后，F(xiàn)PCP高、低劑量組按照各自劑量灌胃，CK及CY組等劑量灌胃生理鹽水。

1.3.3 臟器指數(shù)測定

連續(xù)灌胃小鼠10天后稱取體質(zhì)量并頸椎脫臼處死，在無菌條件下分離胸腺與脾臟并稱重。分別計算胸腺與脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=10×胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；脾臟指數(shù)=10×脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.3.4 血清溶血素水平測定

連續(xù)灌胃小鼠6天后，腹腔注射0.2 mL 2%的雞紅細(xì)胞懸浮液，在第10天眼球取血，1 500 r/min離心10 min，獲取血清，生理鹽水稀釋100倍。取血清稀釋液1 mL，加10%的雞紅細(xì)胞懸浮液0.5 mL、10%的補體（豚鼠血清）1 mL，混勻，于37℃下水浴30 min，置于0℃冰箱中止反應(yīng)。將反應(yīng)液在1 500 r/min條件下離心5 min，取離心上清液于450 nm波長下測定OD值，以生理鹽水作空白調(diào)零。

1.3.5 血清IgG與IgM含量測定

連續(xù)灌胃小鼠10 d，眼球取血，1 500 r/min離心10 min，取血清，然后按照IgG、IgM試劑盒的使用說明書進(jìn)行含量測定。

1.3.6 單核-巨噬細(xì)胞吞噬率測定

連續(xù)灌胃小鼠6天后，于小鼠腹腔注射1 mL濃度為4%的淀粉肉湯，引誘巨噬細(xì)胞向腹腔聚集；2 h后，每只小鼠注射1%的雞紅細(xì)胞懸液1mL。等待2 h，頸椎脫臼處死，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2mL，輕柔5 min，吸取腹腔液1 mL均勻涂于載玻片上，于37℃孵育30 min，用生理鹽水緩慢沖洗1 min，吹干，染色進(jìn)行觀察。計數(shù)：顯微鏡下觀察，以巨噬細(xì)胞數(shù)200個為記數(shù)范圍，同時記數(shù)其中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，計算吞噬率，吞噬率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞/200。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用±s表示。所測數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析法及最小顯著差數(shù)法（least significant diffierence，LSD）進(jìn)行多組數(shù)據(jù)比較；方差不齊時多組比較采用Dunnett's T3法；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FPCP對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響

小鼠胸腺與脾臟圖見圖1，F(xiàn)PCP對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響見表1。

圖1 小鼠胸腺與脾臟圖片F(xiàn)ig.1 Thymus and spleen pictures of mice

表1 FPCP對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，N=10）Table 1 Effect of FPCP on organ index of immunocompromised mice

表1 FPCP對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，N=10）Table 1 Effect of FPCP on organ index of immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

脾臟指數(shù)/（mg/g）CK 49.92±4.85a 90.11±7.26a CY 60 31.16±1.72c 44.13±1.77c CY+FPCP 60+50 34.55±1.31b 48.94±1.49b CY+FPCP 60+100 43.74±5.93a 88.61±3.54a組別 劑量/（mg/kg·BW）胸腺指數(shù)/（mg/g）

表1試驗數(shù)據(jù)顯示，CY模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯偏低，與CK正常組相比差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CY對小鼠免疫器官有顯著的抑制作用，即環(huán)磷酰胺致小鼠免疫低下模型構(gòu)建成功。發(fā)酵茯苓多糖高、低劑量組均可使免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)得到不同程度的升高，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，說明發(fā)酵茯苓多糖對免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有很強的恢復(fù)促進(jìn)作用。FPCP高劑量組能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，雖然不能完全使其恢復(fù)到正常小鼠的數(shù)據(jù)狀態(tài)，但與CK正常組比較無顯著性差異（P＞0.05），且高劑量組脾臟指數(shù)升高程度與CK正常組相當(dāng)。

2.2 FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響

FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響見表2。

表2 FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響（±s，N=10）Table 2 Effect of FPCP on serum hemolysin level in immunocompromised mice

表2 FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響（±s，N=10）Table 2 Effect of FPCP on serum hemolysin level in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

組別劑量/（mg/kg·BW）溶血素水平（OD450）CK 0.65±0.08a CY 60 0.21±0.11c CY+FPCP 60+50 0.42±0.03b CY+FPCP 60+100 0.53±0.12a

由表2可見，CY模型組小鼠血清溶血素水平較CK正常組明顯降低，僅為CK組的32.31%，且差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CY對小鼠血清溶血素水平有顯著抑制作用，即環(huán)磷酰胺致小鼠免疫低下模型構(gòu)建成功。高、低劑量的發(fā)酵茯苓多糖組小鼠血清溶血素水平與CY組比較均差異顯著（P＜0.05），表明發(fā)酵茯苓多糖能有效提高環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠血清中溶血素含量，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。100 mg/kg高劑量發(fā)酵茯苓多糖組溶血素水平為CK正常組的81.54%，表明高劑量發(fā)酵茯苓多糖具有很好的提高小鼠血清溶血素的作用。

2.3 FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響

FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響見表3。

表3 FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響（±s，N=10）Table 3 Effect of FPCP on serum IgG and IgM in immunocompromised mice

表3 FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響（±s，N=10）Table 3 Effect of FPCP on serum IgG and IgM in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

IgM含量/（mg/mL）CK 13.16±0.13a 1.97±0.23a CY 60 7.06±1.38d 1.18±0.02c CY+FPCP 60+50 9.98±0.41c 1.54±0.07b CY+FPCP 60+100 12.79±0.12b 1.95±0.14a組別 劑量/（mg/kg·BW）IgG含量/（mg/mL）

由表3可見，CY模型組小鼠血清IgG與IgM含量較CK正常組明顯降低，分別僅為CK組的53.65%、59.90%，且差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CY對小鼠血清中IgG、IgM含量有顯著抑制作用，即環(huán)磷酰胺致小鼠免疫低下模型構(gòu)建成功。發(fā)酵茯苓多糖高低劑量組IgG、IgM含量較CY組均明顯提高，差異顯著（P＜0.05），表明發(fā)酵茯苓多糖對小鼠血清IgG、IgM含量有顯著提升作用，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。高劑量發(fā)酵茯苓多糖組IgG、IgM含量分別為CK正常組的97.19%、98.98%，相比之下，高劑量發(fā)酵茯苓多糖對小鼠血清中IgM含量的提升作用比對IgG更為明顯。

2.4 FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬率的影響

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞情況見圖2，F(xiàn)PCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬率的影響見表4。

圖2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞情況Fig.2 Absorption of chicken red blood cells by mouse peritoneal macrophages

表4 FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（±S，N=10）Table 4 Effect of FPCP on phagocytosis of mononuclear macrophages in immunocompromised mice

表4 FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（±S，N=10）Table 4 Effect of FPCP on phagocytosis of mononuclear macrophages in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

組別劑量/（mg/kg·BW）吞噬率/%CK 50.47±5.85a CY 60 31.38±5.63c CY+FPCP 60+50 42.47±2.66b CY+FPCP 60+100 45.19±5.74ab

由表4可知，CY模型組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率較CK正常組明顯降低，僅為CK組的62.18%，且差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CY對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率有顯著抑制作用，即環(huán)磷酰胺致小鼠免疫低下模型構(gòu)建成功。高、低劑量的發(fā)酵茯苓多糖組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬率分別為CY組的1.44倍與1.35倍，且與CY組均差異顯著（P＜0.05），表明發(fā)酵茯苓多糖能有效提高環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率。發(fā)酵茯苓多糖高劑量組巨噬細(xì)胞吞噬率與CK正常組無顯著差異，為CK正常組的89.54%，表明高劑量發(fā)酵茯苓多糖能有效提高免疫低下小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率。

3 結(jié)論與討論

研究表明，給小鼠皮下注射環(huán)磷酰胺60mg/kg·BW，連續(xù)3次，可使小鼠臟器指數(shù)、血清溶血素水平、IgG和IgM含量以及巨噬細(xì)胞吞噬率明顯下降，說明小鼠的免疫功能受到抑制，免疫低下模型構(gòu)建成功，給免疫低下模型小鼠灌胃高低劑量（100、50 mg/kg·BW）發(fā)酵茯苓多糖，小鼠臟器指數(shù)、血清溶血素水平、IgG和IgM含量以及巨噬細(xì)胞吞噬率明顯提高，且與環(huán)磷酰胺模型組差異顯著，說明發(fā)酵茯苓多糖可顯著緩解環(huán)磷酰胺對小鼠免疫功能的抑制作用。彭小彬等[12]研究報道了茯苓多糖對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)灌胃100 mg/kg·BW的茯苓多糖能有效提高小鼠血清溶血素水平及IgG與IgM含量，分別達(dá)到CK正常組的72.26%、96.53%、76.91%。本試驗結(jié)果與該報道結(jié)果一致，且經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的茯苓多糖對小鼠溶血素水平及IgG與IgM含量的提高作用強于該報道中未發(fā)酵的茯苓多糖。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數(shù)可以在一定程度上反應(yīng)機體免疫功能的強弱。胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，主要參與細(xì)胞免疫。脾臟中含有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，主要參與體液免疫[13]，表1結(jié)果顯示，灌胃100 mg/kg BW劑量的發(fā)酵茯苓多糖能有效恢復(fù)免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)，胸腺與脾臟指數(shù)分別達(dá)正常水平的87.62%、98.34%，表明發(fā)酵茯苓多糖有較好的增強免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。單核-巨噬細(xì)胞能對外來異物進(jìn)行識別和清除，具有強大的吞噬殺傷作用，吞噬率可以反映機體非特異性免疫功能的強弱[14]，發(fā)酵茯苓多糖能顯著增強免疫低下小鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)功能。

自然界中的多糖多為混合物，具有單糖組成不同、結(jié)構(gòu)差異明顯的特性[15]。對多糖類物質(zhì)的生物活性研究，既包括藥物化學(xué)研究方面，從提取粗多糖（包括去除色素、游離蛋白、小分子雜質(zhì)）到通過離子交換柱、大孔徑樹柱色譜層析法對不同多糖組分進(jìn)行分離純化的過程，也伴隨著藥效學(xué)研究方面，從粗多糖層次證實活性，到各分離純化階段對不同多糖組分進(jìn)行活性追蹤與篩選[16]。通過觀察經(jīng)黑曲發(fā)酵后茯苓多糖對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的免疫調(diào)節(jié)作用，初步提示發(fā)酵茯苓多糖在一定濃度范圍，具有激活機體固有性和適應(yīng)性免疫的生物活性，為進(jìn)一步開展發(fā)酵茯苓多糖的生物活性與機制研究提供了研究基礎(chǔ)。