陳春華，楊士花，初雅潔，李淳，畢曉菲，李晴，羅恒國，李永強(qiáng)，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語學(xué)院，云南昆明650201；3.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南大理671003；4.云南永平縣綜合檢驗檢測院，云南永平672600；5.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南保山678000）

小雜糧作為云南種植業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的特色作物[1]，有著種植面積廣、產(chǎn)量高和品種資源豐富等優(yōu)勢，種植面積占全國的6.1%，產(chǎn)量占全國的7%～11.7%[2]，在糧食產(chǎn)業(yè)開發(fā)中具有較大的潛力。云南省主要的小雜糧包括紅米、黑米、苦蕎、老黑谷米、藜麥、青稞、甜蕎、薏仁、燕麥、紫米等[3-4]。小雜糧中不但含有蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含多酚等功能性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，谷物中酚類化合物約90%為酚酸，阿魏酸含量占酚酸的90%以上[5-7]。小雜糧中多酚含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[8]，具有抗氧化、抗菌、抗衰老等作用，能夠預(yù)防癌癥、預(yù)防心血管疾病[9-11]。

亞硝酸鹽具有發(fā)色、抑菌、防腐、增加風(fēng)味等作用[12-13]，是食品工業(yè)中一種非常重要的添加劑。但是研究表明，亞硝酸鹽可以與二甲胺結(jié)合，生成有致癌作用的二甲基亞硝胺，對人類健康具有潛在威脅[14-15]。多酚具有一定的還原性，亞硝酸鹽具有一定的氧化性，兩者發(fā)生氧化還原反應(yīng)[16]，能夠阻斷亞硝胺合成，進(jìn)而清除亞硝酸鹽。研究發(fā)現(xiàn)果蔬、香辛料和茶葉的多酚對亞硝酸鹽有一定的清除作用[17-19]。目前，關(guān)于小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除作用研究鮮有報道。本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面優(yōu)化確定青稞多酚清除亞硝酸鹽的最佳工藝條件，基于小雜糧中阿魏酸是主要的多酚化合物，所以在此條件下，比較研究10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽的清除作用，為小雜糧的開發(fā)利用提供科學(xué)理論依據(jù)，也為小雜糧的精深加工提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫米：墨江縣農(nóng)業(yè)局；青稞：迪慶藏族自治州農(nóng)科所；老黑谷米：云南迪慶州維西縣攀天閣鄉(xiāng)；藜麥、薏仁、燕麥、紅米、黑米、甜蕎、苦蕎：云南省中儲糧儲備庫。

鹽酸萘乙二胺：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對氨基苯磺酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；亞硝酸鈉：西隴化工股份有限公司；阿魏酸：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；Folin-Ciocalteau試劑：sigma公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；UV-1800CP紫外分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；磨粉機(jī)：廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚的提取

參考文獻(xiàn)[20]略做改動，小雜糧磨粉后，過50目篩，制得面粉樣品，準(zhǔn)確稱取小雜糧面粉20 g于500 mL的燒杯中，加入75%的乙醇400 mL，超聲提取25 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，40℃下減壓濃縮后，然后將濃縮液冷凍干燥，得到小雜糧多酚提取物。

1.3.2 多酚含量的測定

參考文獻(xiàn)[21-22]略做改動，稱取0.05 g的小雜糧多酚提取物于50 mL的離心管中，用乙醇定容至10 mL備用，取小雜糧多酚樣液1 mL于50 mL離心管中，加入0.5 mL的Folin-Ciocalteau，再加入1 mL的飽和Na2CO3，定容至10 mL。在避光處反應(yīng)35 min后，離心10 min，以不加入小雜糧多酚提取液管為空白組，于725 nm測定吸光度，以阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立回歸方程為：

式中：y為多酚含量，μmol；x為阿魏酸濃度，μmol/L；結(jié)果表示為每g樣品所含總多酚相當(dāng)于阿魏酸的微摩爾數(shù)[μmol ferulic acid equivalents（FAE）/g]。

1.3.3 亞硝酸鹽清除率的測定

依據(jù)GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進(jìn)行亞硝酸鹽的測定。準(zhǔn)確移取0.5 mL 200 μg/mL NaNO2置于50 mL的離心管中，加入一定量的小雜糧多酚提取液，用蒸餾水定容至10 mL后，取2 mL反應(yīng)液于50 mL容量瓶中，加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸，搖勻靜置5 min，然后加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，搖勻靜置15 min，于538 nm處測定吸光度。按照下式計算清除率：

式中：A1為未加入小雜糧多酚提取液所測得的吸光度；A2為加入小雜糧多酚提取液所測得的吸光度。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除作用的影響

準(zhǔn)確吸取 0.5、1、1.5、2、2.5 mL 濃度為 25 mmol/mL的青稞多酚提取液于50 mL的離心管中，分別加入0.5 mL的NaNO2（200 μg/mL），用蒸餾水定容至10 mL，在60℃條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應(yīng)液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.4.2 反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響

準(zhǔn)確吸取1 mL濃度為25 mmol/mL的青稞多酚于50 mL的離心管中，加入0.5 mL的NaNO2（200 μg/mL），用蒸餾水定容至 10 mL，分別在 40、50、60、70、80 ℃下反應(yīng)30 min，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應(yīng)液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.4.3 反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除作用的影響

準(zhǔn)確吸取1 mL濃度為25 mmol/mL的青稞多酚于50mL的離心管中，加入0.5mL的NaNO2（200μg/mL），用蒸餾水定容至10 mL，在60℃下分別反應(yīng)10、20、30、40、50 min，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應(yīng)液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）原理[23]，選取反應(yīng)溫度（X1）、反應(yīng)時間（X2）和青稞多酚濃度（X3）3 個因素，設(shè)計三因素五水平試驗，使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果方差分析。

1.3.6 小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除作用的比較研究

準(zhǔn)確吸取1.1 mL濃度為25 mmol/mL的10種小雜糧多酚（多酚含量相同，相當(dāng)于阿魏酸27.5 mmol）于50 mL的離心管中，分別加入0.5 mL的NaNO2（200 μg/mL），用蒸餾水定容至 10 mL，在最佳工藝條件下進(jìn)行反應(yīng)，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應(yīng)液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有樣品重復(fù)3次，采用SPSS 22.0軟件，通過t檢驗方法進(jìn)行 ANOVA分析。采用Design-Expert 8.0.6，通過CCD原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除作用的影響

青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除率的影響見圖1。

圖1 青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.1 The effect of hulless barley polyphenols at different concentrations on nitrite scavenging rate

由圖1可知，隨著青稞多酚用量的增大，青稞多酚對亞硝酸鹽清除率呈增加趨勢，但是當(dāng)多酚用量超過1 mL后，清除作用增加不明顯，可能是由于青稞多酚對亞硝酸鹽的清除作用達(dá)到飽和所致，同時增大用量，會增加成本，所以選擇青稞多酚用量1 mL為宜。

2.2 反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響

反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響Fig.2 The effect of reaction temperature on nitrite scavenging rate

由圖2可知，隨著溫度的增加，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除率呈先上升后下降的趨勢。在60℃時清除率達(dá)到最大值為60.2%，當(dāng)溫度大于60℃時，隨溫度的升高，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除作用呈下降趨勢，原因可能是多酚化合物對熱不穩(wěn)定，溫度過高會使其氧化破壞，所以反應(yīng)溫度選取60℃為宜。

2.3 反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除作用的影響

反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除作用的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除作用的影響Fig.3 The effect of reaction time on nitrite scavenging rate

由圖3可知，隨反應(yīng)時間的增加，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除率呈增加趨勢。但超過30 min時，隨反應(yīng)時間的增加，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除作用增加不明顯。這是因為在30 min內(nèi)，反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)物分子間的碰撞機(jī)率增大，清除作用增加。在30 min后，多酚已經(jīng)基本反應(yīng)完畢，清除率變化不明顯，因此反應(yīng)時間選取30 min為宜。

2.4 青稞多酚清除亞硝酸鹽的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度（X1）、反應(yīng)時間（X2）和青稞多酚用量（X3）3個因素為自變量，設(shè)計三因素五水平試驗。試驗設(shè)計和結(jié)果見表1和2。

利用Design Expert軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型如下：

表1 因素水平表Table 1 Independent variables and test design levels

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and result of central composite design

根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表3可知，該模型的 F=42.91，P＜0.000 1，說明回歸模型高度顯著，失擬項P=0.142 5＞0.05，說明失擬項不顯著，說明回歸方程與實際情況擬合良好，能夠反映亞硝酸鹽的清除作用與青稞多酚用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的關(guān)系?；貧w模型方差分析表見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation

2.4.1 響應(yīng)曲面圖分析

根據(jù)回歸模型做響應(yīng)面的三維圖，如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對亞硝酸鹽清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of the effects of interactions of various factors on the nitrite scavenging rates

由圖4a可知，沿青稞多酚用量軸向等高線更為密集，說明青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除作用的影響更加顯著，青稞多酚用量和反應(yīng)溫度的相互作用對亞硝酸鹽清除的影響顯著。由圖4b可知，反應(yīng)溫度比反應(yīng)時間顯著，曲面相對陡峭。沿反應(yīng)溫度軸向等高線更為密集，表示亞硝酸鹽的清除率對反應(yīng)溫度的變化敏感，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的相互作用對亞硝酸鹽清除的影響不顯著。由圖4c可知，青稞多酚用量比反應(yīng)溫度更加顯著，曲面相對陡峭。沿青稞多酚用量軸向等高線密集，而反應(yīng)時間軸向等高線稀疏，說明亞硝酸鹽清除率對青稞多酚用量變化比對反應(yīng)溫度的變化更為敏感，青稞多酚用量和反應(yīng)時間的相互作用對亞硝酸鹽清除的影響不顯著。

2.4.2 驗證試驗

利用Design-Expert得到各個因素組合最佳工藝條件為青稞多酚用量1.11 mL，在59.04℃的條件下，反應(yīng)33.5 min，對亞硝酸鹽的清除率的理論值為63.72%?？紤]操作的實際，修正3個數(shù)據(jù)組合為青稞多酚用量1.1 mL，反應(yīng)溫度59℃，反應(yīng)時間34 min，在該條件下，進(jìn)行了驗證試驗，得到青稞多酚對亞硝酸鹽的清除率為64.04%（RSD=0.46%），與理論值十分接近，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，此工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.5 云南10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除率

云南10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除率見圖5。

圖5 云南10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除率Fig.5 Nitrite scavenging rates of 10 small grains polyphenols in Yunnan province

研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸為谷物中主要的多酚化合物[5-7]，所以本文采用青稞多酚清除亞硝酸鹽的工藝條件比較10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽的清除作用。由圖5可知，在最佳工藝條件下，10種小雜糧中多酚對亞硝酸鹽清除范圍為23.90%～86.24%，黑米多酚（86.24±1.00）%和紫米多酚（83.59±1.53）%對亞硝酸鹽的清除能力顯著高于其他小雜糧多酚（p＜0.05），藜麥多酚（23.90±2.42）%對亞硝酸鹽的清除能力顯著低于其它小雜糧多酚（p＜0.05）。這可能是不同小雜糧中含有的多酚種類和組成有差異，不同多酚類化合物所含的酚羥基數(shù)量及位置不同，影響到其對亞硝酸鹽的清除作用。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳條件為青稞多酚用量1.1 mL，反應(yīng)溫度59℃，反應(yīng)時間34 min，對亞硝酸鹽的清除率為64.04%。10種小雜糧中多酚對亞硝酸鹽清除范圍為23.90%～86.24%，其中黑米（86.24±1.00）%和紫米（83.59±1.53）%對亞硝酸鹽的清除作用顯著高于其他小雜糧（p＜0.05），藜麥（23.90±2.42）%對亞硝酸鹽的清除作用顯著低于其它小雜糧（p＜0.05）。小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，因而后面的研究可進(jìn)一步對小雜糧提取物進(jìn)行分離純化，并探討它們對亞硝酸鹽清除作用的構(gòu)效關(guān)系，為小雜糧的開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。