（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北科技大學(xué)生物工程學(xué)院，河北石家莊050000）

體外化學(xué)試驗(yàn)是篩選具有清除自由基活性物質(zhì)的重要手段，目前報(bào)道的有4大類24種方法，這些方法在不同的研究中均有應(yīng)用[1-6]，由于不同實(shí)驗(yàn)室采用的方法不同，篩選得到的具有抗氧化活性物質(zhì)的可比性和重復(fù)性存在一定的差異。特別是在抗氧化肽開發(fā)應(yīng)用中，探索具有重復(fù)性較強(qiáng)的體外化學(xué)試驗(yàn)方法將有利于抗氧化肽高通量快速篩選。本研究以公認(rèn)的體外抗氧化性較強(qiáng)的還原性谷胱甘肽[7-8]為研究對(duì)象，對(duì)在抗氧化肽開發(fā)過程中常用的清除DPPH·[9-10]、ABTS+·、·O2-、·OH，測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD），還原Fe3+和Cu2+能力試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比研究驗(yàn)證，從而尋找出適合在抗氧化肽初篩中的最適方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷胱甘肽、ABTS、DPPH：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；抗氧化肽 467（Pro-His-Cys-Lys-Arg-Met）、抗氧化肽568（Pro-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Tyr-Val-Arg-Ala-Val-Leu-His-Leu）、抗氧化肽 567（Val-Tyr-Gln-Phe-Leu）、抗氧化肽 580（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）：上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、鐵氰化鉀、無水硫酸銅、新銅試劑、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、醋酸銨、冰乙酸-脂肪酸蔗糖酯均為分析純：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；超氧陰離子自由基（superoxide radical，·O2-）測(cè)試盒、羥自由基（hydroxyl free radical，·OH）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美析儀器有限公司；HW·SY11型電熱恒溫水浴鍋：北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.3 主要試劑配置

1.3.1 抗氧化肽母液配制

水溶性肽：蒸餾水直接溶解，配制成1 g/mL的溶液；水溶性較差的肽：加入乳化劑脂肪酸蔗糖酯配置成1g/mL的乳濁液。根據(jù)試驗(yàn)的實(shí)際需要，用蒸餾水稀釋成一系列不同濃度的使用液。

1.3.2 VC對(duì)照品配制

將VC配制成0.1 mg/mL的VC母液。根據(jù)試驗(yàn)的實(shí)際需要，用蒸餾水將VC母液稀釋至不同倍數(shù)，得到一系列不同濃度的使用液。

1.4 方法

1.4.1 清除DPPH·試驗(yàn)

DPPH·測(cè)定過程中試劑的加量見表1。按照表1加入配好的試劑，搖勻后室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)定其吸光度。按照公式（1）進(jìn)行清除率計(jì)算。

表1 DPPH·測(cè)定過程中試劑的加量Table 1 The amount of reagent in the DPPH·determination

式中：Ac表示3 mL DPPH·與1 mL待測(cè)樣避光反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)定的吸光度；Ad表示1 mL待測(cè)樣與3 mL乙醇避光反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)定的吸光度；Ak表示3 mL DPPH·與1 mL樣品溶劑避光反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)定的吸光度。

1.4.2 清除ABTS+·試驗(yàn)

由于ABTS+·在734 nm處進(jìn)行測(cè)定，多肽在該波長下對(duì)測(cè)定沒有干擾。按照表2進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公式（2）計(jì)算清除率。

表2 ABTS+·測(cè)定過程中試劑的加量Table 1 The amount of reagent in the ABTS+·determination

式中：Ac表示3.6 mL ABTS+·與0.4 mL待測(cè)樣避光反應(yīng)5 min，734 nm測(cè)定的吸光度；M表示3.6 mL ABTS+·與0.4 mL樣品溶劑避光反應(yīng)5 min，734 nm測(cè)定的吸光度。

1.4.3 清除羥自由基（·OH）試驗(yàn)

按照試劑盒使用說明進(jìn)行試驗(yàn)，適當(dāng)調(diào)整樣品濃度。

1.4.4 清除超氧陰離子自由基（·O2-）試驗(yàn)

按照試劑盒使用說明進(jìn)行試驗(yàn)，適當(dāng)調(diào)整樣品濃度。

1.4.5 鐵離子還原能力試驗(yàn)

試驗(yàn)步驟和試劑配制參考文獻(xiàn)[11]。

1.4.6 銅離子還原能力試驗(yàn)

試驗(yàn)步驟和試劑配制參考文獻(xiàn)[12]。

1.4.7 測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）能力試驗(yàn)

按照試劑盒使用說明進(jìn)行試驗(yàn)，適當(dāng)調(diào)整樣品濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用orign8.0和SPSS15.0；其中DPPH·、ABTS+·、·O2-、·OH 和 SOD 采用被測(cè)量的拮抗劑的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）評(píng)價(jià)清除效果，根據(jù)清除率與濃度的對(duì)數(shù)呈線性的關(guān)系利用orign8.0回歸得到直線方程，而后計(jì)算得到；Fe3+和Cu2+還原能力采用吸光度在0.72（記做IC0.72）處的濃度評(píng)價(jià)比較，將吸光度與濃度做線性方程后求得0.72處吸光度的濃度。為了避免操作過程中造成的誤差，以VC作為參考。最后對(duì)自由基清除評(píng)價(jià)采用相對(duì)清除率（relative clearance rate，RIC），即抗氧化肽的清除率與VC的清除率的比值見公式（3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一試驗(yàn)人員7種方法測(cè)定谷胱甘肽抗氧化能力結(jié)果比較

采用1.4的試驗(yàn)方法測(cè)定谷胱甘肽抗氧化能力，結(jié)果見表3。

表3 谷胱甘肽抗氧化能力比較Table 3 The comparison of antioxidant capacity of glutathione

從表3中可知，采用不同方法評(píng)價(jià)谷胱甘肽的抗氧化能力結(jié)果存在較大的差異，這樣對(duì)于新型抗氧化肽的開發(fā)存在無法比較的問題。從各種方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，S-RIC）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）發(fā)現(xiàn)，采用化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定的DPPH·和測(cè)定SOD活性的試驗(yàn)對(duì)谷胱甘肽的抗氧化性評(píng)價(jià)較為合理。

DPPH·作為一種穩(wěn)定的化學(xué)自由基在測(cè)定過程中受外界因素影響小，精密度較高可以作為抗氧化肽篩查方法考慮；SOD具有較強(qiáng)的活性，在體內(nèi)正常代謝過程中存在，黃嘌呤氧化法已經(jīng)較為成熟，在較多的書籍中均有該方法的詳細(xì)描述，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是精密度還是變異系數(shù)均可以接受，也可以作為抗氧化肽篩選方法的一種。而·OH作為最活潑的羥自由基，其變異系數(shù)達(dá)到了34.81%，這樣對(duì)于新型抗氧化肽的篩選非常不利。ABTS+·法雖然精密度高，但每進(jìn)行一次測(cè)定均需重新校準(zhǔn)測(cè)定液吸光度，這也是導(dǎo)致其變異系數(shù)較大的原因。采用·O2-篩選抗氧化肽的精密度和變異系數(shù)均不理想，采用金屬離子鐵和銅進(jìn)行篩選，雖然精密度較好，但是變異系數(shù)較大，因此也不太適合新型抗氧化肽的篩選。

2.2 利用DPPH·和SOD法評(píng)價(jià)合成抗氧化肽568、580、467和 567

利用確定的DPPH·和SOD的方法測(cè)定4種合成的抗氧化肽的活性結(jié)果見表4。從表4中利用這兩種方法測(cè)定4種肽的變異系數(shù)較低，說明這兩種方法可以有效的作為篩選抗氧化肽的方法。

2.3 不同試驗(yàn)人員對(duì)7種方法測(cè)定谷胱甘肽抗氧化能力的作用結(jié)果

為了驗(yàn)證試驗(yàn)的穩(wěn)定性另外3名試驗(yàn)人員按照試驗(yàn)步驟和方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

表4 4種合成抗氧化肽對(duì)DPPH·和SOD的作用結(jié)果Table 4 The removal of DPPH·and SOD by four synthetic antioxidant peptides

表5 谷胱甘肽抗氧化能力比較的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The verification test results of glutathione antioxidant capacity comparison

從表5中可知對(duì)于同一試驗(yàn)人員和不同試驗(yàn)人員來講，DPPH·和SOD的變異系數(shù)都比較低，因此采用這兩種方法進(jìn)行抗氧化肽的篩選具有可行性。

2.4 不同試驗(yàn)人員對(duì)4種抗氧化肽作用DPPH·和SOD的試驗(yàn)結(jié)果

另外3名試驗(yàn)人員對(duì)合成的4種肽進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表6所示。

從表6中可知無論是試驗(yàn)人員自己的變異系數(shù)還是不同試驗(yàn)人員之間的變異系數(shù)均在可接受范圍內(nèi)，從而證實(shí)采用DPPH·和SOD進(jìn)行抗氧化肽的篩選具有可行性。

表6 驗(yàn)證4種合成抗氧化肽對(duì)DPPH·和SOD的作用結(jié)果Table 6 The verification of the effects of four synthetic antioxidant peptides on DPPH·and SOD

3 結(jié)論

在篩選抗氧化肽方法的試驗(yàn)中，·OH作為最活潑的羥自由基，其變異系數(shù)高達(dá)34.81%；ABTS+·法、采用金屬離子鐵和銅進(jìn)行篩選，雖然精密度高，但變異系數(shù)較大；采用·O2-篩選抗氧化肽的精密度和變異系數(shù)均不理想。因此以上5種方法均不太適合抗氧化肽的篩選。

清除DPPH·和SOD無論是精密度還是變異系數(shù)均在可接受范圍，具有良好的穩(wěn)定性、易操作性及重現(xiàn)性，因此清除DPPH·和SOD可以作為抗氧化肽初步篩選的方法。