胃癌是中國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率高,起病隱匿,治療效果不理想,進展期胃癌5年生存率不足30%[1]。胃癌的高發(fā)年齡為55～70歲,在中國有接近一半的病人是老年病人。因此,深入開展胃癌基礎(chǔ)研究,闡明胃癌的分子機制,對老年胃癌的診斷和治療具有十分重要的意義。近年來研究表明,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)在腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成及凋亡的調(diào)控等方面發(fā)揮著非常重要的作用[2-4]。LncRNA是一類長度超過200 nt 的RNA 分子,不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[5]。起初LncRNA一度被認(rèn)為是基因組中的“垃圾”,轉(zhuǎn)錄的“噪音”,但是隨著高通量測序等生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)LncRNA 在包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。眾多證據(jù)表明LncRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。在前期工作中,我們利用基因芯片與生物信息學(xué)技術(shù),對胃癌及其癌旁組織中差異表達的LncRNA進行了篩選，分析發(fā)現(xiàn) LEF1-AS1 在胃癌中高表達,可能是調(diào)節(jié)胃癌惡性表型及預(yù)測病情的重要LncRNA之一。本文就LncRNA LEF1-AS1的表達水平與胃癌病人的臨床及病理特征進行分析,同時觀察了LncRNA LEF1-AS1 與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系,以期為胃癌的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2014年1～12月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的73例胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本,其中男56例,女17例,年齡65～81歲,中位年齡69歲;腫瘤細(xì)胞分化程度:Ⅲ級或低分化腺癌54例,Ⅰ～Ⅱ級腺癌19例;腫瘤分期采用國際TNM 分期法:Ⅰ期13例,Ⅱ期13例,Ⅲ期47例;有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例,無轉(zhuǎn)移19例;腫瘤浸潤深度T1～T2 22例,T3～T4 51例。病人均未接受術(shù)前放療、化療及其他針對胃癌的治療。所有胃癌標(biāo)本均由兩位有經(jīng)驗的高年資病理醫(yī)師閱片評分。

1.2 總RNA提取 RNA提取試劑TriIzol 購自美國Invitrogen 公司。稱取50～100 mg 胃癌組織,邊研磨邊加入液氮,充分研磨后移入EP 管中,加入1 mL Trizol。按Trizol試劑說明書提取組織和細(xì)胞的總RNA。測定RNA 濃度及純度。最后通過1% 的瓊脂糖凝膠電泳對RNA 進行完整性檢測。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司,2組引物分別為LncRNA LEF1-AS1-F: AAGGACGAGAGAAAAGCAC和LncRNA LEF1-AS1-R: CACACAAAGGGGAAGACC。 GAPDH-F: ACAGTCAGCCGCATCTTCT和 GAPDH-R: GACAAGCTTCCCGTTCTCAG。

按試劑盒說明書步驟進行實驗。先進行反轉(zhuǎn)錄操作,獲取cDNA,反應(yīng)條件37 ℃15 min,85 ℃ 5 s,反應(yīng)產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱。參照定量PCR反應(yīng)試劑盒說明書對LncRNA LEF1-AS1 進行檢測,實時PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸15 s,共40個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參照,每組樣本重復(fù)3次取均值。

1.4 免疫組化 采用免疫組化Envision法,操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。PI3K(Cell Signaling)、Akt(Cell Signaling)均為兔抗人多克隆抗體,工作濃度1∶100;即用型第二代免疫組化Envision試劑盒(Dako K5007)。染色后觀察PI3K、Akt蛋白的分布和陽性率。每張切片均分別由兩位病理科醫(yī)生進行盲讀,有爭議的切片經(jīng)協(xié)商后取得統(tǒng)一意見。PI3K蛋白的陽性表達為細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色,Akt蛋白的陽性表達為細(xì)胞胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。以陽性細(xì)胞的著色深度計分:無色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;再在高倍鏡下取4個不同視野,各計數(shù)200個細(xì)胞,按陽性細(xì)胞所占的百分比計分:陰性為0分,陽性細(xì)胞≤10%為1分,11%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分,染色強度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≥2分為免疫反應(yīng)陽性(+),否則計為免疫反應(yīng)陰性(-)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。相對表達量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不同病理表型組LncRNA LEF1-AS1 基因表達量的差異分析采用t檢驗,Pearson 相關(guān)性分析用于檢驗LncRNA LEF1-AS1 基因的表達量與組織免疫組化之間的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier 分析,組間比較采用Log-rank 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中LncRNA LEF1-AS1的表達 腫瘤組織中的LncRNA LEF1-AS1 明顯高于癌旁正常組織(LncRNA LEF1-AS1相對表達量2-ΔΔCt法,2.47±0.87 比 0.53±0.28),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 胃癌組織中LncRNA LEF1-AS1的表達與臨床病理特征的關(guān)系 如圖1所示,LncRNA LEF1-AS1 表達量和病人的性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān),但是組織分化差、腫瘤浸潤程度深(T分期)、TNM 分期高的病人LncRNA LEF1-AS1 表達量更高(P<0.001)。

圖1 胃癌組織中LncRNA LEF1-AS1 表達量和病人臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中 LEF1-AS1 與PI3K、Akt表達的關(guān)系 胃癌組織中PI3K,Akt的陽性表達率分別為53.4%(47/73)、37.1% (41/73)(圖2)。Pearson 相關(guān)性分析顯示,胃癌組織中LncRNA LEF1-AS1 表達與PI3K表達呈正相關(guān)(r=0.6723,P<0.01),與Akt表達亦呈正相關(guān)(r=0.4673,P<0.01)。

圖2 免疫組化染色檢測PI3K、Akt在胃癌組織中的表達(200×)

2.4 LEF1-AS1表達與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系 LEF1-AS1 低表達組和高表達組的胃癌病人術(shù)后中位無病生存期(disease-free survival,DFS)分別為32個月和14個月, Kaplan-Meier 分析顯示,LncRNA LEF1-AS1 高表達的胃癌病人DFS明顯低于低表達組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖3)。

圖3 LncRNA LEF1-AS1 表達與胃癌病人DFS的關(guān)系

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。目前胃癌的防治已經(jīng)成為我國醫(yī)療衛(wèi)生方面的重點和難點。老年病人對早期胃癌的癥狀反應(yīng)遲鈍,又因為合并癥多,臟器功能明顯差于年輕病人,影響了治療方案的選擇。LncRNA作為近年來備受關(guān)注的一類非編碼RNA,在腫瘤形成、增殖和轉(zhuǎn)移的過程中起著廣泛而重要的作用。LncRNA的功能及作用機制較為復(fù)雜,是目前RNA 基因組學(xué)研究的熱點。

LncRNA LEF1-AS1 定位于人類染色體4q25,最初是由Strausberg等[9]應(yīng)用基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的,但當(dāng)時并未對其功能進行闡述。此后針對 LncRNA LEF1-AS1的研究并不多,我們可以在口腔鱗癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤上見到零星報道[10-12]。前期我們利用基因芯片與生物信息學(xué)技術(shù)篩選出該LncRNA。進一步研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中的LncRNA LEF1-AS1的表達遠(yuǎn)高于癌旁組織,其高表達與腫瘤病灶浸潤程度深、分化程度差、分期晚有密切關(guān)系,與性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能無關(guān)?，F(xiàn)有結(jié)果說明, LncRNA LEF1-AS1 主要的生物學(xué)作用可能是影響腫瘤分化和惡性生物學(xué)行為，從而影響胃癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。這與Wang等[10]的研究有相似之處,他們在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤上的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA LEF1-AS1與腫瘤的增殖及凋亡明確相關(guān)。我們的研究還發(fā)現(xiàn),LncRNA LEF1-AS1 高表達的胃癌病人DFS明顯低于低表達者,表明檢測LncRNA LEF1-AS1 表達可作為判斷胃癌病人預(yù)后的指標(biāo)。

生物信息學(xué)軟件分析表明，LncRNA LEF1-AS1 的生物學(xué)行為可能通過競爭性吸附某些miRNA,影響PI3K的表達,從而干擾PI3K/Akt通路的活性。進一步應(yīng)用免疫組化方法檢測了PI3K/Akt的表達,發(fā)現(xiàn)LncRNA LEF1-AS1的增高確實與這些蛋白的高表達有關(guān)。PI3K/Akt通路在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中扮演重要角色[13-14]，但LncRNA LEF1-AS1是否能夠影響PI3K/Akt通路,其具體分子生物學(xué)機制,尚需進一步研究證實。

綜上所述,LncRNA LEF1-AS1 在胃癌中的作用機制可能是復(fù)雜的,多通路調(diào)節(jié)的。深入研究其生物學(xué)功能及作用機制,將為進一步闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供新的理論依據(jù),為老年胃癌病人的診治提供新的方法。