胡 敏， 韓要武， 李 璐， 馬克龍， 呂 磊， 張道芹， 楊建澳， 汪思應(yīng)

(1安徽中醫(yī)藥大學(xué)， 安徽 合肥 230012； 2安徽醫(yī)科大學(xué)， 安徽 合肥 230032)

惡性腫瘤已成為嚴(yán)重危害人類生命健康第1位的疾病。最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018 年全球新增腫瘤病例1 800多萬(wàn)，腫瘤死亡病例900多萬(wàn)，其中全球 48.4%的發(fā)病病例和57.3% 的死亡病例來(lái)自亞洲[1]。惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤患者的主要致死因素。因此針對(duì)惡性腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及其機(jī)制的探索具有重要意義。腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成。

自1971年Folkman[2]提出如果沒(méi)有支持腫瘤生長(zhǎng)的血管生成，實(shí)體瘤不能超過(guò)1～2 mm3的假設(shè)至今，已有40多年的研究結(jié)果證實(shí)，腫瘤血管生成在大多數(shù)實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和惡性進(jìn)展中起重要作用[3-4]，是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的核心[2],因此抑制血管生成被認(rèn)為是阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的策略之一[5]。而建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠的血管生成模型為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管生成提供了基礎(chǔ)。本項(xiàng)工作首先利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)及小鼠內(nèi)皮細(xì)胞SVEC4-10EE2在體外建立三維血管生成模型，在此基礎(chǔ)上加入腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231和E0771)與之共培養(yǎng)，觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)血管生成的影響，并探究其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

Cytodex3磁珠購(gòu)自Amersham Pharmacia；乙醇、纖維蛋白原、抑肽酶、凝血酶和SU5416購(gòu)自Sigma；DMEM培養(yǎng)液、胰酶和小牛血清購(gòu)自Gibco；鏈霉素、青霉素和兩性霉素B購(gòu)自HyClone；EGM-2培養(yǎng)液購(gòu)自Lonza；單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)及MCP-1受體C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2,CCR2)拮抗劑購(gòu)自Calbiochem；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和MCP-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京華邁科生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)，從新鮮人胎盤(pán)中分離，并在EGM-2培養(yǎng)液中生長(zhǎng)培養(yǎng)，使用第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞SVEC4-10EE2和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)； 小鼠乳腺癌細(xì)胞E0771細(xì)胞在含有10%FBS、青霉素(1×105U/L)/鏈霉素(100 mg/L)和兩性霉素B(0.25 g/L)的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2體外三維血管生成模型的建立 按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行模型的建立[6]。分別將正常培養(yǎng)生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs和SVEC4-10EE2用胰蛋白酶消化后，取1×106個(gè)細(xì)胞與4 mL含有cytodex3磁珠(3×103)的培養(yǎng)液后在50 mL離心管中混合。將混合液在5%CO2、37 ℃條件下溫育培養(yǎng)，每20 min輕輕搖動(dòng)1次。培養(yǎng)4 h后再加入4 mL相應(yīng)培養(yǎng)液，使細(xì)胞具有足夠的營(yíng)養(yǎng)，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后將含有細(xì)胞和cytodex3磁珠的混合液轉(zhuǎn)移至25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中孵育過(guò)夜。第2天，將培養(yǎng)瓶中的混合液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并用20 mL不含Ca2+和Mg2+的PBS輕輕洗滌3遍，然后將包被有內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs或SVEC4-10EE2的cytodex3磁珠重懸于pH 7.4、含有2.5 g/L纖維蛋白原和150 U/L抗胰蛋白酶的培養(yǎng)液中。接下來(lái)把包被有內(nèi)皮細(xì)胞的cytodex3磁珠和纖維蛋白原混合溶液加入預(yù)先用0.625 U新鮮凝血酶包被的24孔板中，每孔0.5 mL，使纖維蛋白原/磁珠溶液在室溫下凝結(jié)5 min，然后在37 ℃和5%CO2環(huán)境中凝結(jié)20 min。向每個(gè)孔中加入1 mL含有150 U/L抗胰蛋白酶的培養(yǎng)液,在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min。用移液器將24孔板內(nèi)上層培養(yǎng)液輕輕吸掉，用含有150 U/L抗胰蛋白酶的1 mL新鮮培養(yǎng)液替換。

2.3體外內(nèi)皮細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng) 為了觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)血管生成的影響，在體外三維血管生成模型基礎(chǔ)上，將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細(xì)胞E0771在體外與之共培養(yǎng)。方法同2.2，只是最后一步，在加入抗胰蛋白酶平衡的30 min等待時(shí)間內(nèi)，準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度。移液器將24孔板內(nèi)上層培養(yǎng)液輕輕吸掉后，用1 mL含有MDA-MB-231和E0771細(xì)胞(分別為4×104和2×104個(gè))的培養(yǎng)液取代EGM-2和DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4血管生成結(jié)果判斷 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用4%多聚甲醛固定， DAPI染色，在倒置顯微鏡下觀察血管生成情況。每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算生成血管的磁珠占總數(shù)的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量 在內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè) VEFG和MCP-1 的表達(dá)水平。

2.6VFGF及MCP-1對(duì)血管生成的影響 在內(nèi)皮細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中分別加入MCP-1(10 ng)、MCP-1受體CCR2的拮抗劑(20 nmol/L)以及VEGF受體的抑制劑SU5416(2 μmol/L)作用48 h，觀察VEGF及MCP-1在腫瘤細(xì)胞刺激血管生成中的作用。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血管內(nèi)皮細(xì)胞體外三維血管生成模型

正常培養(yǎng)生長(zhǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs經(jīng)cytodex3磁珠混合培養(yǎng)4 h后，內(nèi)皮細(xì)胞可黏附于磁珠表面生長(zhǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜后內(nèi)皮細(xì)胞與磁珠的附著更加緊密。將附著有內(nèi)皮細(xì)胞的cytodex3磁珠懸浮于纖維蛋白凝膠中培養(yǎng)，48 h后可以觀察到內(nèi)皮細(xì)胞能夠形成短而窄的3-D脈管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1A，提示血管的生成。接下來(lái)用4%多聚甲醛固定并用DAPI染色，在熒光顯微鏡下采集圖像，可以看到血管芽和毛細(xì)血管網(wǎng)由多細(xì)胞形成，見(jiàn)圖1B。結(jié)果證實(shí)建立了細(xì)胞體外三維血管生成模型。在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上也可以見(jiàn)到同樣的改變。

2 腫瘤細(xì)胞體外促進(jìn)血管生成

在加入人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與HUVECs共培養(yǎng)后，顯著增加了血管芽的長(zhǎng)度和數(shù)量，而且加入MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)后生成血管的磁珠所占比例為68.7%，比HUVECs單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的48.3%顯著提高(P<0.05),見(jiàn)圖2A。在小鼠乳腺癌細(xì)胞E0771加入SVEC4-10EE2細(xì)胞后也能觀察到同樣的結(jié)果(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。

Figure 2.Tumor cells induce angiogenesis in vitro. A: The images of HUVECs with sprouts were captured at 48 h after culture. The percentage of beads with sprouts was determined (bottom panel); B: The images of SVEC4-10EE2 with sprouts were captured at 48 h after culture. The percentage of beads with sprouts was determined (bottom panel). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs HUVECs group； #P<0.05 vs SVEC4-10EE2 group.

3 腫瘤細(xì)胞體外促進(jìn)MCP-1和VEGF分泌

在培養(yǎng)48 h后，分別收集有或無(wú)腫瘤細(xì)胞刺激的培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測(cè)上清液中VEFG和MCP-1 的水平。結(jié)果顯示，與內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，加入腫瘤細(xì)胞刺激之后，上清液內(nèi)VEFG和MCP-1 水平顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Tumor cells increased the expression of MCP-1 and VEGF in vitro. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs HUVECs group；#P<0.05 vs SVEC4-10EE2 group.

4 條件培養(yǎng)基(conditioned media, CM)對(duì)體外血管生成的影響

收集腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液作為條件培養(yǎng)基(HUVEGs中加入的CM為HUVEGs與MDA-MB-231共培養(yǎng)的上清；SVEC4-10EE2中加入的CM為SVEC4-10EE2與E0771共培養(yǎng)的上清)，加入到 HUVECs或SVEC4-10EE2單獨(dú)培養(yǎng)的血管生成系統(tǒng)，在有或無(wú)MCP-1受體CCR2的拮抗劑以及VEGF受體抑制劑SU5416條件下觀察血管生成的情況。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞刺激后的條件培養(yǎng)上清可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，而這一作用可以被CCR2的拮抗劑以及 SU5416 所阻斷(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effect of the conditioned medium on angiogenesis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; ##P<0.05 vs CM group.

5 VEGF參與腫瘤細(xì)胞體外誘導(dǎo)的血管生成

結(jié)果顯示，加入VEGF受體抑制劑SU5416(2 μmol/L)后，腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231及E0771誘導(dǎo)的血管生成受到了顯著的抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.VEGF promoted the angiogenesis induced by cancer cells in vitro. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs co-culture group.

6 MCP-1參與腫瘤細(xì)胞促進(jìn)的體外血管生成

外源性MCP-1可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，而CCR2拮抗劑(20 nmol/L)可顯著抑制兩種腫瘤細(xì)胞(MDA-MB231或E0771)誘導(dǎo)的血管生成(P<0.05),見(jiàn)圖6。

Figure 6.MCP-1 promoted the angiogenesis of HUVECs and SVEC4-100E2 cells in vitro. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs MCP-1 group.

討 論

血管生成是腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的重要條件, 也是血道轉(zhuǎn)移的根本保證[7]。大多數(shù)實(shí)體瘤分泌促血管生成因子，誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)，為生長(zhǎng)中的腫瘤提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)，支持其進(jìn)展并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供通道[2,8]。在過(guò)去的幾十年中，血管生成受到了非常多的關(guān)注，靶向血管生成的治療成為控制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要策略。建立血管生成模型可以為研究腫瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。腫瘤血管生成主要通過(guò)出芽的方式發(fā)生[9]。相對(duì)于二維血管生成模型，三維培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞更接近于體內(nèi)細(xì)胞形態(tài)學(xué)表型和基因表達(dá)譜的特征[10-11]。因此，本研究中我們根據(jù)Chen等[6]的研究報(bào)道，建立一個(gè)穩(wěn)定、可重復(fù)、易操作的體外三維血管生成模型。實(shí)驗(yàn)中所用的Cytodex3磁珠可以有效地附著和擴(kuò)散細(xì)胞，并且可以容易地對(duì)附著的細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡檢查。纖維蛋白凝膠由親水性交聯(lián)原纖維組成，適用于3D細(xì)胞培養(yǎng)[12]。首先我們利用人或鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC或SVEC4-10EE2)包被于Cytodex3磁珠表面，并置于纖維蛋白凝膠系統(tǒng)中。內(nèi)皮細(xì)胞在不加入任何生長(zhǎng)因子的條件下，在培養(yǎng)體系內(nèi)以“出芽”的方式形成短而窄的脈管樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們成功建立了一個(gè)體外血管生成模型。

接下來(lái)，我們想觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)血管生成是否具有促進(jìn)作用。利用成功建立的體外血管生成模型，在培養(yǎng)液上層纖維蛋白凝集物內(nèi)分別加入乳腺癌腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231和E0771，使之與對(duì)應(yīng)的正常內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，建立一個(gè)3-D內(nèi)皮細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，即HUVECs/MDA-MB-231和SVEC4-10EE2/E0771共培養(yǎng)系統(tǒng)。培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)血管生成的作用。結(jié)果顯示，加入腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，無(wú)論是HUVECs/MDA-MB-231還是SVEC4/E0771，形成血管芽的長(zhǎng)度和數(shù)量顯著增加，出芽率顯著增高，提示腫瘤細(xì)胞在體外可以顯著促進(jìn)血管生成。

由于內(nèi)皮細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的3-D系統(tǒng)中，腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間并沒(méi)有直接接觸，加入腫瘤細(xì)胞后可以促進(jìn)血管生成，我們考慮這一作用必定由來(lái)自腫瘤細(xì)胞的分泌分子介導(dǎo)。報(bào)道指出[13]，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生各種促血管生長(zhǎng)因子，如VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)、MCP-1、血管生成素(angiopoietin，Ang)和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)等，它們通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤新生血管生成。VEGF是一種分泌蛋白，是生理和病理性的血管形成中最重要的因子之一，已經(jīng)證實(shí)它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中均起到重要作用[14]。在腫瘤微環(huán)境中，VEGF有多種來(lái)源，包括腫瘤細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、血小板和血管細(xì)胞[15], 通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞上兩種高親和力受體酪氨酸激酶VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2 / KDR(Flk-1)對(duì)腫瘤血管生成的多個(gè)方面進(jìn)行調(diào)節(jié)。MCP-1是促使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到達(dá)炎癥區(qū)的化學(xué)引誘物，參與多種炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展[16]，是腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]；同時(shí)MCP-1也是一種有效的血管生成趨化因子。為了探討腫瘤細(xì)胞刺激血管生成的機(jī)制，在本研究中，我們分別收集了有或無(wú)腫瘤細(xì)胞刺激的培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測(cè)上清液中VEFG和MCP-1的水平，結(jié)果在加入腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，VEGF和MCP-1的水平與內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比顯著增加，即腫瘤細(xì)胞刺激后上清液內(nèi)MCP-1以及VEGF水平增高。收集腫瘤細(xì)胞刺激后的上清液作為條件培養(yǎng)基, 加入到 HUVECs或SVEC4-10EE2 單獨(dú)培養(yǎng)的血管生成系統(tǒng)，結(jié)果顯示CM可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成血管，而這一作用可以被CCR2的拮抗劑以及 SU5416 所阻斷。隨后在3-D共培養(yǎng)體系下層培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的纖維蛋白凝膠中加入MCP-1、VEGF受體抑制劑SU5416及MCP-1受體CCR2抑制劑。結(jié)果顯示，加入外源性MCP-1后，可顯著促進(jìn)共軛體系中血管生成；而在加入SU5416及CCR2抑制劑后，HUVECs/MDA-MB-231和SVEC4-10EE2/E0771誘導(dǎo)的血管生成受到了顯著的抑制，證據(jù)支持VEGF和MCP-1參與了體外腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的新生血管生成的過(guò)程。

本研究首先建立了一個(gè)體外3-D血管生成系統(tǒng)，可以直觀的觀察腫瘤血管生成的情況，為靶向血管治療提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，腫瘤細(xì)胞可以刺激血管生成，初步證實(shí)這一現(xiàn)象與腫瘤分泌物MCP-1及VEGF相關(guān)。