李書(shū)國(guó)， 劉菊菊， 葉 明， 鄧娟娟， 張 丹， 彭 艷

(三峽大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所&宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科， 湖北 宜昌 443003)

細(xì)胞衰老是細(xì)胞在外界環(huán)境改變或內(nèi)部特定基因表達(dá)變化等因素作用下喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[1]。細(xì)胞衰老是一種正常的生理機(jī)制，也是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，其可以引起組織修復(fù)能力減弱，還通過(guò)分泌衰老相關(guān)分泌表型因子[2]，參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松和神經(jīng)退化性疾病等慢性疾病有關(guān)[3]。研究表明，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)衰老在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制中起著重要作用[4-5]，因此，VSMCs衰老的調(diào)控可能成為未來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化防治的靶點(diǎn)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNAs，miRNAs)在細(xì)胞衰老過(guò)程中有重要的作用，參與細(xì)胞衰老的miRNAs包括miRNA-15、17、29、34、217和885等[6-9]，其中miR-17可以抑制細(xì)胞老化，促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用化學(xué)修飾方法探討miR-17對(duì)VSMCs衰老的影響及機(jī)制，以了解miR-17可能在VSMCs衰老調(diào)控中的潛在作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

10只雄性Sprague-Dawley(SD)清潔級(jí)大鼠，6周齡，體重150～200 g，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma；p16和p21單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz。D-半乳糖和β-半乳糖苷酶染色試劑購(gòu)自上海阿拉丁生化公司；逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Gene Copoeia。

2 方法

2.1大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs體外培養(yǎng)與分組 采用頸椎脫位法處死大鼠。無(wú)菌條件下剪開(kāi)大鼠皮膚，分離胸主動(dòng)脈，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs。用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全匯合后傳代培養(yǎng)，獲得純度98%以上的VSMCs，取3～6代VSMCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用免疫熒光方法鑒定VSMCs。細(xì)胞隨機(jī)分為6組：誘導(dǎo)衰老+miR-17過(guò)表達(dá)(aging induction+miR-17 mimics, A-miR-17)組、誘導(dǎo)衰老+miR-17敲減(aging induction+miR-17 inhibitor, A-anti-miR-17)組、誘導(dǎo)衰老對(duì)照(A-control)組、正常培養(yǎng)+miR-17 mimics (normal+miR-17 mimics, N-miR-17)組、N-anti-miR-17組和N-control組。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將miR-17-mimics和miR-17-inhibitor導(dǎo)入相應(yīng)的過(guò)表達(dá)或敲減組，24 h后加入D-半乳糖(10 g/L)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，正常培養(yǎng)組則加常規(guī)培養(yǎng)液。

2.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的VSMCs，轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞接種于6孔板， 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；轉(zhuǎn)染前2 h換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。每個(gè)培養(yǎng)孔加轉(zhuǎn)染混合液1 mL，并前后輕輕搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使混合液與培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液混勻；細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后吸出混合液換入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3β-半乳糖苷酶染色 各組細(xì)胞衰老檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，清洗液清洗1次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫靜置5 min后吸出固定液，加入適量酸性液(pH 6.0)，10 min后吸出酸性液，加入預(yù)熱的染色工作液，置入37 ℃、無(wú)CO2的培養(yǎng)箱，孵育3～16 h后光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。計(jì)數(shù)藍(lán)染的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每次隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，衰老細(xì)胞陽(yáng)性率(%)=衰老細(xì)胞數(shù)/100個(gè)細(xì)胞×100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 采用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)期miR-17和衰老相關(guān)基因的表達(dá)情況。提取細(xì)胞總RNA合成cDNA，構(gòu)建合適的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min； RT-qPCR檢測(cè)：50 ℃ 2 min, 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；70 ℃～90 ℃繪制熔解曲線。每個(gè)樣本檢測(cè)3次，p16和p21以GAPDH為內(nèi)參照，miR-17以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行評(píng)估，分析目的基因的表達(dá)。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：miR-17(擴(kuò)增長(zhǎng)度為248 bp，Tm=56 ℃)：上游引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCTGC-3′，下游引物序列為5′-TGCGCCAAAGTGCTTACAGTGCA-3′；U6的上游引物序列為5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列為5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；p16(擴(kuò)增長(zhǎng)度為241 bp，Tm=56 ℃)的上游引物序列為5′-CGTACCCCGATACAGGTGATG-3′，下游引物序列為5′-CGTCGTGATGTCCCCGCTCT-3′；p21(擴(kuò)增長(zhǎng)度為188 bp，Tm=56 ℃)：上游引物序列為5′-CTGGTGATGTCCGACCTGTTCC-3′，下游引物序列為5′-ACGCTCCCAGACGTAGTTGCC-3′；GAPDH (擴(kuò)增長(zhǎng)度為253 bp，Tm=56 ℃)上游引物序列為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物序列為5′- TTTGAGGGTGCAGCG-AACTT-3′。

2.5免疫組化(免疫熒光)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 細(xì)胞爬片；4%的多聚甲醛固定15 min，空氣干燥5 min，PBS清洗標(biāo)本3次，0.5% Triton X-100孵育20 min。PBS清洗標(biāo)本1次，3% H2O2孵育15 min；PBS清洗標(biāo)本1次；封閉血清孵育20 min，滴加I抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過(guò)夜； PBS清洗標(biāo)本3次，滴加適量生物素標(biāo)記II抗工作液，37 ℃孵育10～30 min；PBS 沖洗，DAB顯色劑顯色3～5 min；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。免疫熒光與免疫組化步驟相同，換用帶熒光標(biāo)記的II抗。免疫組化染色檢測(cè)p16蛋白表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)p21蛋白表達(dá)情況。所有的免疫組化圖片采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量平均吸光度值，進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組均數(shù)間比較用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VSMCs鑒定

大鼠VSMCs原代提取、培養(yǎng)，通過(guò)抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle antibody, α-SMA)免疫熒光染色鑒定，高倍鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞呈典型的“谷-峰狀”生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色的、與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維絲，即α-肌動(dòng)蛋白絲，核居中，呈卵圓形，表明血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)成功。見(jiàn)圖1。

Figure 1.The immunofluorescence staining was used to identify the rat vascular smooth muscle cells.

2 血管平滑肌細(xì)胞miR-17表達(dá)水平的檢測(cè)

D-半乳糖誘導(dǎo)VSMCs衰老的第14天收集細(xì)胞，提取RNA，采用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-17的表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，A-control組miR-17的表達(dá)顯著高于A-anti-miR-17組(P<0.01)，而較A-miR-17組顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2，說(shuō)明miR-17-inhibitor和miR-17-mimics成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

Figure 2.The expression of miR-17 in VSMCs on the fourteenth day after D-galactose induced senescence. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs A-control group; #P<0.05 vs N-control group.

3 miR-17對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的VSMCs衰老的影響

3.1光鏡觀察VSMCs形態(tài) D-半乳糖誘導(dǎo)后的第3天，在100倍光鏡下觀察VSMCs形態(tài)。結(jié)果顯示，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞與正常培養(yǎng)基組的細(xì)胞相比顯著增大，形態(tài)多樣化，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The morphology of VSMCs on the third day after D-galactose induced senescence.

3.2β-半乳糖苷酶染色鑒定細(xì)胞衰老 D-半乳糖誘導(dǎo)后的第3天，采用β-半乳糖苷酶染色方法鑒定細(xì)胞衰老情況，結(jié)果顯示，與N-miR-17組相比，A-miR-17組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(P<0.05);與N-anti-miR-17組相比,A-anti-miR-17組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(P<0.01)；與N-control組相比，A-control組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(P<0.01)。A-anti-miR-17 組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞顯著高于A-miR-17組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The expression of β-galactosidase in VSMCs on the third day after D-galactose induced senescence. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs N-miR-17 group; ##P<0.01 vs N-anti-miR-17 group; △P<0.05 vs N-control group; ▲P<0.05 vs A-miR-17 group.

3.3免疫組化檢測(cè)p16蛋白表達(dá) D-半乳糖誘導(dǎo)衰老后的第14天采用免疫熒光法檢測(cè)VSMCs中p16蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，p16蛋白在A-miR-17組的表達(dá)較 N-miR-17組顯著增加(P<0.01)，在A-anti-miR-17組的表達(dá)較N-anti-miR-17組顯著增加(P<0.01)，而在A-control組的表達(dá)較A-anti-miR-17組顯著降低(P<0.01)，其余各組相互之間無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The p16 protein expression in VSMCs on the fourteenth day after D-galactose induced senescence. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs N-miR-17 group; ##P<0.01 vs N-anti-miR-17 group; △△P<0.01 vs A-control group.

3.4免疫熒光法檢測(cè)p21蛋白表達(dá) D-半乳糖誘導(dǎo)衰老后的第14天采用免疫熒光法檢測(cè)VSMCs中p21蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，A-anti-miR-17組p21的表達(dá)較A-miR-17和A-control組顯著增加(P<0.01)；N-anti-miR-17組p21的表達(dá)較N-miR-17和N-control組顯著增加(P<0.01)。p21 在D-半乳糖誘導(dǎo)組中的表達(dá)較對(duì)應(yīng)的正常培養(yǎng)組均顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 6.The p21 expression in VSMCs on the fourteenth day after D-galactose induced senescence. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs A-anti-miR-17 group;##P<0.01 vs N-anti-miR-17 group;△△P<0.01 vs N-miR-17 group;▲▲P<0.01 vs N-anti-miR-17 group; &&P<0.01 vs N-control group.

3.5RT-qPCR檢測(cè)p16和p21的mRNA表達(dá) D-半乳糖誘導(dǎo)后的3、7和14天采用RT-qPCR檢測(cè)VSMCs細(xì)胞內(nèi)p16和p21的mRNA表達(dá)。p16 mRNA的RT-qPCR結(jié)果顯示，在第3天和第7天，6組相互之間均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，在第14天，A-anti-miR-17組的p16 mRNA顯著高于A-miR-17組，其余各組間p16 mRNA表達(dá)亦無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖7。

p21 mRNA的RT-qPCR結(jié)果顯示，導(dǎo)入anti-miR-17的細(xì)胞，無(wú)論是否加入D-半乳糖誘導(dǎo)，p21 mRNA表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加(P<0.01)。在D半乳糖誘導(dǎo)和正常衰老過(guò)程中，過(guò)表達(dá)miR-17使VSMCs 的p21表達(dá)顯著減少，抑制miR-17導(dǎo)致VSMCs 的p21表達(dá)顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖7。

Figure 7.The p16 and p21 mRNA expression in VSMCs was detected using RT-qPCR on days 3,7 and 14 after D-galactose-induced senescence.Mean±SD.n=3.* P<0.05,**P<0.01 vs A-control group.

討 論

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞生長(zhǎng)永久阻滯在細(xì)胞周期的G1期，細(xì)胞在形態(tài)、生化及表觀遺傳上出現(xiàn)特征變化，是正常細(xì)胞必然的歸宿[11]。在人體內(nèi)，細(xì)胞衰老與許多慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病以及慢性腎臟病等[12-13]。

VSMCs衰老導(dǎo)致血管老化，衰老的VSMCs表型轉(zhuǎn)換促使血管壁中層肥厚、膠原沉積和血管鈣化等血管重構(gòu)，導(dǎo)致血管疾病產(chǎn)生[14-15]。研究顯示[16]，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊平滑肌細(xì)胞衰老與端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(telomere repeat binding factor 2, TRF2)有關(guān)，衰老的VSMCs既促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，又促進(jìn)斑塊易損性，預(yù)防VSMCs衰老可能是動(dòng)脈粥樣硬化潛在的治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察D-半乳糖誘導(dǎo)3 d后，衰老誘導(dǎo)組的VSMCs較N組細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多樣化。D-半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率較正常細(xì)胞均明顯增加，說(shuō)明D-半乳糖誘導(dǎo)的VSMCs衰老模型建立成功。通過(guò)檢測(cè)VSMCs內(nèi)miR-17 mRNA的表達(dá)水平顯示miR-17-mimics和miR-17-inhibitor成功轉(zhuǎn)入VSMCs細(xì)胞。D-半乳糖誘導(dǎo)3 d后，A-anti-miR-17 組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于A-miR-17組，說(shuō)明miR-17能夠抑制大鼠VSMCs衰老。

根據(jù)引起衰老原因的不同，細(xì)胞衰老可被分為復(fù)制性衰老[15]和過(guò)早型衰老[17]2種，復(fù)制性衰老主要依賴于p53-p21Cip1/Waf1信號(hào)通路[18]，過(guò)早型衰老的發(fā)生與p53-p21Cip1/Waf1和p16INK4a/Rb信號(hào)通路的激活相關(guān)[19]。p16INK4a/Rb與p53-p21Cip1/Waf1信號(hào)通路是細(xì)胞衰老過(guò)程中至關(guān)重要的2條信號(hào)通路[20]，當(dāng)這2條通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，如p21蛋白表達(dá)下降或細(xì)胞周期蛋白cyclin D的表達(dá)上調(diào)時(shí)，可以延緩細(xì)胞衰老或繞過(guò)衰老程序繼續(xù)增殖。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p16蛋白和mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)衰老組和正常培養(yǎng)組早期表達(dá)沒(méi)有顯著增加，但14 d后有顯著增加。過(guò)表達(dá)和抑制miR-17未導(dǎo)致p16顯著變化，說(shuō)明miR-17抑制VSMCs衰老不是通過(guò)p16實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)p21蛋白和mRNA的表達(dá)顯示，誘導(dǎo)衰老組和正常培養(yǎng)組VSMCs中p21表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)均有顯著增加；過(guò)表達(dá)miR-17導(dǎo)致p21表達(dá)顯著減少，抑制miR-17表達(dá)使p21表達(dá)顯著增加，說(shuō)明miR-17抑制VSMCs衰老與p21有關(guān)。

綜上所述，miR-17能夠抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠VSMCs衰老，其機(jī)制與p21表達(dá)有關(guān)。有必要深入研究miR-17在VSMCs衰老調(diào)控中作用及其在動(dòng)脈粥樣硬化防治中的潛在作用。