趙小陽，虞哲高，劉志英，汪忠艷，楊金樞，劉文欣，何劍洋

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2.帝斯曼營養(yǎng)產(chǎn)品部中國研發(fā)中心，上海 201203；3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 101102；4.廣州愛保農(nóng)飼料有限公司，廣東廣州 510080；5.浙江新和成股份有限公司，浙江杭州 312500；6.巴斯夫維生素有限公司，遼寧沈陽 110141；7.廈門金達(dá)威維生素有限公司，福建廈門 361028）

維生素A 可保護(hù)上皮組織，維持正常視覺功能，促進(jìn)機(jī)體和骨骼的生長，防治角膜軟化、干眼病等[1]。因此，維生素A 多以乙酸酯形式添加到飼料中，用于促進(jìn)動(dòng)物的健康生長發(fā)育。

維生素A 用作飼料添加劑通常有明膠包埋和淀粉包埋2 種劑型，國標(biāo)分析方法（GB/T7292-1999）[2]主要針對(duì)微型膠囊技術(shù)、明膠包埋的產(chǎn)品，測定時(shí)需加入堿性蛋白酶，其作用是酶解包埋維生素A 的微囊外膜，使維生素A 釋放出來溶于乙醇溶液。事實(shí)上，除堿性蛋白酶外，其他商品化蛋白酶制劑如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等也可用于明膠包埋產(chǎn)品中維生素A 含量的測定。對(duì)于淀粉包埋產(chǎn)品，尤其是為避免使用動(dòng)物源性原料帶來的安全隱患及出口地區(qū)限制，市場上出現(xiàn)的采用雙重乳化工藝用淀粉包埋的飼料添加劑維生素A 產(chǎn)品，如何選擇更好的方法檢測其含量也是企業(yè)迫切需要了解的問題。

本文旨在探討商品化淀粉酶制劑在飼料添加劑維生素A 產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用問題。為此，選用菠蘿蛋白酶檢測了明膠包埋的維生素A 產(chǎn)品含量，結(jié)果與用堿性蛋白酶測試的結(jié)果吻合，幫助企業(yè)擴(kuò)大了酶的選擇空間；通過用淀粉酶檢測淀粉包埋的維生素A 產(chǎn)品含量發(fā)現(xiàn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 試劑 無水乙醇，國產(chǎn)優(yōu)級(jí)純試劑；乙腈、異丙醇為色譜純，購于Fisher Scientific 公司；菠蘿蛋白酶：20 萬U/g，淀粉酶：1 萬U/g，為國產(chǎn)試劑；全反式維生素A 乙酸酯對(duì)照品，購于Dr.Ehrenstorfer 公司，含量≥96.0% ；全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，自配；全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，自配。

1.2 儀器設(shè)備 分析天平（感量為0.000 1g、0.000 01g），德國Sartorius 公司（SQP QUINTIX224，BP211D）；超聲波振蕩提取器，美國SmithKline 公司（BRANSON B-32）；高效液相色譜儀，配有紫外吸收檢測器（或二極管矩陣檢測器），Agilent 1100；0.22 μm 微孔濾膜。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：精確稱取80～90 mg（精確至0.000 01 g）全反式維生素A 乙酸酯對(duì)照品，置于50 mL 棕色容量瓶中，加入30～40 mL 無水乙醇，置于超聲水浴中處理2 min 使之完全溶解，用無水乙醇稀釋到刻度，搖勻。全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的濃度約為1 600～1 800 μg/mL（可密閉冷凍保存12 個(gè)月）。

全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液10 mL 于100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋到刻度，搖勻，配成160～180 μg/mL 的全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（可密閉冷凍保存2 個(gè)月）。

1.3.2 超聲提取時(shí)間的確定 GB/T7292-1999 方法中，試樣超聲提取10 min，但對(duì)于不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品，由于包埋工藝不同，提取效果有差異，因此首先分別對(duì)試樣超聲提取10、30、40 min，以確定最適時(shí)間（表1）。由表1 可知，超聲提取30 min，提取完全，結(jié)果穩(wěn)定，40 min 時(shí)測定值呈下降趨勢。

1.3.3 酶解提取 根據(jù)酶的最佳酶活條件，選擇適合的提取溫度及提取溶液，見表2。堿性蛋白酶組依據(jù)GB/T7292-1999 方法：稱取200 mg 試樣，加入200 mg 堿性蛋白酶、10 mL 0.1%氨水溶液，45℃超聲波水浴中處理30 min，再用乙醇提取稀釋，用外標(biāo)法定量。菠蘿蛋白酶和淀粉酶組方法為：稱取100 mg（精確至0.000 1g）試樣，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入100 mg 菠蘿蛋白酶、10 mL 水，于55℃超聲水浴中超聲提取30 min（或者加入100 mg 淀粉酶、10 mL 水，于70℃超聲水浴中超聲提取30 min），冷卻至室溫，加入無水乙醇振搖提取，然后用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，高效液相色譜檢測。

1.3.4 直接提取 準(zhǔn)確稱取100 mg（精確至0.000 1g）試樣，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL 水，45℃超聲水浴中超聲提取30 min，加入無水乙醇振搖提取，然后用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，高效液相色譜檢測。

1.4 色譜條件

1.4.1 色譜條件的選擇 同GB/T7292-1999 方法[2]。色譜柱：LiChrospher 100RP-18，內(nèi)徑4.6 mm，長250 mm，粒度5 μm，或性能相當(dāng)者。流動(dòng)相：乙腈+異丙醇+水=1 500+250+250。流速：1.0 mL/min。檢測波長：326 nm。進(jìn)樣量：5 μL。全反式維生素A 乙酸酯色譜峰見圖1，維生素A 乙酸酯色譜圖見圖2。

圖1 全反式維生素A 乙酸酯色譜圖

圖2 維生素A 乙酸酯色譜圖

1.4.2 色譜柱的選擇 在色譜分離中，不同品牌的C18色譜柱對(duì)于順、反式維生素A 乙酸酯的分離情況是存在差異的，有些C18柱無法將順、反式維生素A 乙酸酯分開，由于維生素A 乙酸酯的含量是以順、反式維生素A 乙酸酯之和計(jì)算，因此是否將順、反式維生素A乙酸酯分開對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果沒有影響。本研究使用的一種色譜柱能夠分離順、反式維生素A 乙酸酯，根據(jù)表3 測試結(jié)果，順式維生素A 乙酸酯占總維生素A 乙酸酯的量不超過9%。

1.5 主要技術(shù)內(nèi)容分析論證

1.5.1 線性范圍 準(zhǔn)確稱取103.2 mg維生素A乙酸酯對(duì)照品，用乙醇溶解定容至100.0 mL，制備成3 000 IU/mL 的維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋成濃度為150～2 400 IU/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣5 μL 至高效液相色譜儀。如圖3 所示，當(dāng)維生素A 乙酸酯的濃度在150～2 400 IU/mL 時(shí)，回歸系數(shù)為0.999 42，濃度和峰面積之間存在很好的線性。

表1 不同提取時(shí)間的檢驗(yàn)結(jié)果

表2 酶的提取條件

表3 順、反維生素A 乙酸酯含量比值

1.5.2 順式和反式維生素A 乙酸酯的定性試驗(yàn) 由于飼料級(jí)維生素A 乙酸酯都是化學(xué)合成的，在合成過程中，會(huì)生成少量維生素A 乙酸酯順式異構(gòu)體，同樣具有維生素A 的效價(jià)，因此在計(jì)算時(shí)應(yīng)將維生素A 乙酸酯的順-反異構(gòu)體峰面積合并計(jì)算。

稱取約85～90 mg 全反式維生素A 乙酸酯對(duì)照品，溶于100 mL 乙醇中。吸取5.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)貯備液于50 mL容量瓶中，用0.000 1 mol/L 的碘甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置10 min 后，滴加數(shù)滴1%硫代硫酸鈉溶液，使容量瓶中的黃色溶液褪色，將該溶液注入高效液相色譜儀，即得含全反式維生素A 乙酸酯和順式維生素A乙酸酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，色譜圖見圖4。

2 結(jié)果

圖3 維生素A 乙酸酯不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與峰面積響應(yīng)值線性關(guān)系

圖4 全反式維生素A 乙酸酯和順式維生素A 乙酸酯色譜圖

由表4 可知，用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解處理7 批次不同生產(chǎn)廠商生產(chǎn)的明膠包埋飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品，得到的結(jié)果與標(biāo)示值非常吻合。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為商品化蛋白酶制劑在飼料添加劑維生素A 含量測試中的酶的選擇提供了空間。表4 還比較了用堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶及淀粉酶酶解處理4 批次用淀粉包埋的飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品。從結(jié)果上看，用這3種酶酶解處理試樣獲得的結(jié)果無明顯差異。

由表5 可知，對(duì)于用明膠包埋的維生素A 乙酸酯微囊，測試結(jié)果均低于產(chǎn)品標(biāo)示量，用淀粉包埋的測試結(jié)果與產(chǎn)品的標(biāo)示量相吻合。

通過檢測7 家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的飼料級(jí)維生素A 乙酸酯含量，檢測結(jié)果均不低于標(biāo)示值，用不同酶酶解提取檢測結(jié)果相對(duì)偏差不大于3%，表明檢測準(zhǔn)確度高。

3 討 論

在生產(chǎn)過程中將適量的維生素A 油、抗氧化劑及明膠通過噴霧干燥，即制成明膠包埋的維生素A 的微囊產(chǎn)品。由于交聯(lián)作用，部分維生素A 油油滴包裹在明膠基質(zhì)內(nèi)，而明膠不溶于水，這些包裹在明膠內(nèi)的維生素A 油油滴不能釋放出來，導(dǎo)致用直接提取法測定維生素A 的提取率低，測定結(jié)果均低于產(chǎn)品的標(biāo)示量。而對(duì)于淀粉包埋的維生素A 的微囊產(chǎn)品，由于產(chǎn)品的基質(zhì)為可溶于水的淀粉，用水超聲處理后，淀粉擴(kuò)散到水中，破壞了產(chǎn)品的微囊結(jié)構(gòu)，微囊內(nèi)的維生素A 易被有機(jī)溶劑所提取，測試結(jié)果與產(chǎn)品的標(biāo)示量相吻合。

對(duì)于明膠包埋的維生素A 微囊產(chǎn)品，在樣品前處理過程中，通常采用皂化的方法（如飼料中維生素A的測定）或酶解的方法（如飼料添加劑維生素A 的測定）破膜后，再用有機(jī)溶劑提取。但對(duì)于明膠包埋的維生素A 微囊產(chǎn)品分析來說，關(guān)注點(diǎn)在于將明膠交聯(lián)的結(jié)構(gòu)打破，用有機(jī)溶劑將基質(zhì)內(nèi)的維生素A 提取出來。本研究用菠蘿蛋白酶酶解飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品得到了滿意結(jié)果。

表4 酶解提取檢測結(jié)果

表5 直接提取測試結(jié)果

淀粉酶酶解處理與其他2 種處理方法有所差異。這是因?yàn)樵嚇拥幕|(zhì)是淀粉，用堿性蛋白酶或菠蘿蛋白酶處理試樣起作用的是水，在試樣超聲過程中，包埋微囊的淀粉溶于水而分散于水中，維生素A 易被下一步加入的乙醇所提取。用淀粉酶酶解處理，除包埋微囊的淀粉溶于水而分散于水中之外，淀粉酶還能夠使大分子的淀粉結(jié)構(gòu)酶解成小分子的單糖結(jié)構(gòu)。在某些特定條件下，用商品化淀粉酶制劑測定淀粉包埋的飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品還是有意義的。因?yàn)閷?duì)于用淀粉包埋的維生素A 微囊，儲(chǔ)存條件不當(dāng)或放置時(shí)間過長，會(huì)使淀粉老化，試樣用水處理時(shí)，會(huì)有部分淀粉不溶，導(dǎo)致部分維生素A 的油滴包裹在不溶淀粉基質(zhì)內(nèi)部，低估了實(shí)際的含量，而用淀粉酶酶解處理能解決淀粉老化導(dǎo)致含量偏低的問題。

此外，順式維生素A 乙酸酯含量反映維生素A 乙酸酯生產(chǎn)工藝質(zhì)量，使用企業(yè)在送檢產(chǎn)品時(shí)可提出檢測順式維生素A 的含量。本研究中分離順反式維生素A 乙酸酯時(shí)所用的色譜柱為LiChrospher?100RP-18 4.6×250 mm 5 μm，但該品牌的色譜柱并非是本方法唯一指定的色譜柱，凡能達(dá)到相同結(jié)果的其他品牌色譜柱也能使用。

4 小 結(jié)

本研究通過對(duì)堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶及淀粉酶酶解提取方法的驗(yàn)證表明，對(duì)于明膠包埋的維生素A 乙酸酯，用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解可以提取完全，測試結(jié)果穩(wěn)定。對(duì)于淀粉包埋的維生素A 乙酸酯，根據(jù)淀粉易溶于水的性質(zhì)，無論用哪種酶酶解，由于加水超聲提取，都能提取完全；也可以選擇不加酶，直接加水超聲提取，可降低試驗(yàn)成本，提高試驗(yàn)效率；如果淀粉包埋的產(chǎn)品檢測結(jié)果低于標(biāo)示值，可先查看其保質(zhì)期，之后最好用淀粉酶酶解處理再次檢測。本研究介紹的分析方法適用性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，分析成本低，可為飼料級(jí)維生素A 的檢測提供有效的檢測依據(jù)。