劉海濤 羅 慶 范 立 楊 甜

1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，江西南昌 330006；2.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院五官教研室，江西南昌 330052

變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種以變應(yīng)原激發(fā)、IgE 介導(dǎo)、T 輔助細(xì)胞（Th）2 反應(yīng)為主的慢性鼻部疾?。?］。主要分類(lèi)是Th1、Th2 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）［2］。Th1細(xì)胞分泌γ 干擾素（IFN-γ）和白細(xì)胞介素（IL）-2 等細(xì)胞因子，Th2 細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13。在這些細(xì)胞因子中，Treg 細(xì)胞調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡起關(guān)鍵作用［3-4］。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控蛋白（SOCS）2 是SOCS 家族中的重要成員［5-6］。Knosp 等［7］研究證明，SOCS2 基因敲除小鼠對(duì)Th2 介導(dǎo)的氣道炎癥的易感性增加。本研究初步觀察SOCS2 在AR 組織中的表達(dá)情況及與炎性因子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源與分組

AR 組選取南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018 年2～7 月行鼻中隔偏曲或翼管神經(jīng)切斷術(shù)的AR 患者20 例，男11 例，女9 例，年齡20～69 歲。對(duì)照組鼻中隔偏曲且無(wú)其他鼻科疾病的患者15 例，男8 例，女7 例，年齡18～65 歲。取下鼻甲前端鼻黏膜剪成兩份，一份置于4%多聚甲醛固定；另一份放入含有Trizol 的離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)移到冰箱中保存。

1.2 試劑與材料

SOCS2 兔抗人多克隆抗體（bs-1896R）購(gòu)于北京博奧森有限公司。Trizol 購(gòu)于Invitrogen 公司。通用型試劑盒（小鼠/兔聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)pv-6000）、正常山羊血清（ZLI-9022）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（ZLI-9017）購(gòu)于北京中衫金橋有限公司。

1.3 免疫組化法檢測(cè)SOCS2 表達(dá)

標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24 h、常規(guī)石蠟包埋，脫蠟，修復(fù)抗原，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用正常山羊血清封閉，滴加一抗SOCS2（1∶300），4℃過(guò)夜，PBS 沖洗3 次，加辣根酶標(biāo)記抗山羊IgG 室溫孵育1 h，顯色劑顯色，樹(shù)膠封片。陰性組以封閉液替代一抗。將圖像輸入Image-pro Plus 6.0 專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件，計(jì)算平均吸光度值。

1.4 SOCS2 mRNA 及T 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)

引物合成：在GenBank 查找人類(lèi)SOCS2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、FOXP3 序列，引物設(shè)計(jì)和檢測(cè)采用Primer 5.0 軟件。引物由華大基因有限公司合成。引物序列如下，SOCS2：5'-ACGCGAACCCTTCTCTGACC-3'，5'-CATTCCCGGAGGGCTCAAGG-3'；IFN-γ：5'-AGTGATGGCTGAACTGTCGC-3'，5'-CTGGGATGCTCTTCGACCTC-3'；IL-4：5'-GTGCACCGAGTTGACCGTAA-3'，5'-GCGAGTGTCCTTCTCATGGT-3'；IL-5：5'-GGATGCTTCTGCATTTGAGTTT-3'，5'-CAGTGCCAAGGTCTCTTTCA-3'；IL-13：5'-CTGCAATGGCAGCATGGTAT-3'，5'-TCAGCATCCTCTGGGTCTTC-3'；FOXP3：5'-GAAACAGCACATTCCCAGAGTTC-3'，5'-ATGGCCCAGCGGATGAG-3'；GAPDH：5'-AAATCAAGTGGGGCGATGCT -3'，5'-CAAATGAGCCCCA -GCCTTCT-3'。用Trizol 試劑從鼻組織中提取總RNA。用寡聚體（dT）18 引物和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa Bio Inc）從2 μg 總RNA 中合成cDNA。用ABI PRISM 7600檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)加州福斯特市生物系統(tǒng)）和SYBR 預(yù)混Taq（TaKaRa Bio Inc）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。計(jì)算樣本復(fù)制物的循環(huán)閾值（Ct）。計(jì)算靶基因mRNA水平的倍數(shù)變化為2-ΔΔCt。qPCR 儀（StepOneTMReal-Time PCR System）進(jìn)行mRNA 定量檢測(cè)，反應(yīng)條件如下：95℃變性30 s；95℃，15 s；60℃，1 min 退火、延伸，共40 個(gè)循環(huán)。

1.5 AR 患者視覺(jué)模擬評(píng)分（VAS）

評(píng)價(jià)六大癥狀（噴嚏、流涕、鼻癢、鼻塞、眼癢和流淚）。方法：患者在標(biāo)尺上標(biāo)出各種癥狀相應(yīng)分值，“0”代表無(wú)此種癥狀，“10”代表此種癥狀最重，統(tǒng)計(jì)VAS總分［8-9］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q）］表示，采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；確定變量線(xiàn)性關(guān)系采用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR 組與對(duì)照組的SOCS2 免疫組化表達(dá)及平均吸光度值比較

SOCS2 在AR 組和對(duì)照組中均有免疫組化表達(dá)。AR 組SOCS2 平均吸光度值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖1（封四）。

2.2 AR 組與對(duì)照組SOCS2 和細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量比較

qRT-PCR 顯示，AR 組的SOCS2、IFN-γ 和FOXP3相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，IL-5、IL-13、IL-4 相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 AR 患者SOCS2 與細(xì)胞因子和VAS 總分的相關(guān)性

AR 患者SOCS2 相對(duì)表達(dá)與IL-4、IL-5、IL-13、VAS 總分相對(duì)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.66、-0.50、-0.51、-0.65，P ＜0.05），與FOXP3 相對(duì)表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.67，P ＜0.05），與IFN-γ 相對(duì)表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.39，P ＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 AR 組與對(duì)照組SOCS2 和細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 AR 患者SOCS2 與細(xì)胞因子和VAS 總分的相關(guān)性

3 討論

AR 的發(fā)病機(jī)制為環(huán)境中刺激因子作用于具有遺傳背景的個(gè)體，引起T、B 淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)為T(mén)h2 的優(yōu)勢(shì)活化［10-13］。研究證實(shí)［14］，SOCS2 參與Th 細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)，抑制Th2 細(xì)胞分化和發(fā)育，對(duì)Treg 穩(wěn)定有重要作用［15-16］。

本研究顯示，AR 組SOCS2 免疫組化表達(dá)和平均吸光度值均較對(duì)照組降低。SOCS2 優(yōu)先在天然調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和誘導(dǎo)的Treg 中表達(dá)［9，17］。SOCS2 對(duì)維持iTreg的抗炎功能是必需的，可將SOCS2 作為T(mén)h2 型偏移疾病的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)［18］。

本研究結(jié)果顯示，AR 組的SOCS2、IFN-γ 和FOXP3相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，IL-5、IL-13、IL-4 相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相符［18-19］。臨床中常用VAS 來(lái)評(píng)估AR 癥狀的嚴(yán)重程度［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，SOCS2 可作為臨床上評(píng)估AR 病情的一個(gè)參考指標(biāo)。

綜上所述，SOCS2 在AR 組織中表達(dá)降低與多種因子相關(guān)，在AR 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。后期還將進(jìn)一步研究細(xì)胞因子在AR 中的免疫功能和發(fā)病機(jī)制。