郝建華 包毅敏 包 蕓 鹿 偉 張超偉 郝藝杰

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

隨著人們生活水平和飲食結構的改變，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后，排名第三位的威脅人類健康的慢性系統(tǒng)性疾?。?-2］。DM 中90%以上的患者屬于2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），其發(fā)病率高，病程長，易引發(fā)心腦血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等多種并發(fā)癥，使T2DM 的預防和治療成為研究的熱點；T2DM 的發(fā)病因素多，病理機制復雜，研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機制與體內(nèi)多種代謝相關酶、血糖調(diào)節(jié)相關信號通路關系密切，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acticated protein kinase，AMPK）、PI3K/Akt、缺氧誘導因子（HIF-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、FoxO、NF-κB 等多種信號通路廣泛參與了血糖的調(diào)控［3-4］，使T2DM 的發(fā)病機制成為研究的難點。通過對T2DM 代謝相關信號通路的研究，明確作用靶點，開發(fā)調(diào)節(jié)血糖代謝相關信號通路的抑制劑或激活劑，對臨床治療具有重要意義。

中藥治療T2DM 具有多途徑、多通道、多靶點、多效應的優(yōu)勢，在臨床中被廣泛應用。大黃黃連瀉心湯出自《傷寒雜病論》，臨床應用能夠降糖、降脂、減輕體重，能夠改善患者多飲、多食等癥狀，對于T2DM 有較好的療效［5-8］。本實驗采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）法構建T2DM 大鼠模型，觀察大黃黃連瀉心湯對糖脂代謝的影響，對骨骼肌中腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）、葡萄糖轉運蛋白4（glucose tRNAsporter 4，GLUT4）表達的影響，探討大黃黃連瀉心湯調(diào)節(jié)糖脂代謝與AMPK 信號通路的相關性，尋找其作用靶點，為臨床應用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼料

SPF 級健康雄性Wister 大鼠40 只，體重（200±20）g，8 周齡，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2015-0001，SPF 級使用環(huán)境由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（蒙）2015-0001，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心非屏障室，室溫20℃，濕度50%～70%，光暗周期（12 h/12 h），動物自由攝食飲水；高糖高脂飼料（豬油10%、糖20%、膽固醇2.5%、膽酸鈉0.5%、基礎飼料67%）購于北京科澳協(xié)力飼料有限責任公司。

1.2 實驗藥物及主要試劑

大黃黃連瀉心湯（根據(jù)《金匱要略》所載的配比劑量，大黃∶黃連∶黃芩為2∶1∶1）購于內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)院；二甲雙胍（北京利齡制藥廠，生產(chǎn)批號：161014）；STZ（美國SIGMA 公司，貨號：SO-130，批號：18883-66-4）；大鼠葡萄糖試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號：YZB/滬2624-40-2014）；三酰甘油（TG）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A110-1）；總膽固醇（TC）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A111-1）；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A113-1）；Phospho-AMPKα（Thr172）（40H9）Rabbit mAb（美國CST 公司，批號：CST 2535S）；AMPKα Rabbit mAb（美國CST公司，批號：CST 2603S）；PCG-1α Mouse mAb（美國CST 公司，批號：CST 2705S）；GLUT4 Mouse mAb（美國CST 公司，批號：CST 2823S）；AMPKα PGC-1α GLUT4 引物設計合成（生工生物工程股份有限責任公司，批號：111085660）；血糖儀（北京華益靜點生物技術有限公司，批號：878P19904000266）；PrimeScript RT 試劑盒（thermo 公司，批號：K1622）；BCA 試劑盒（Solarbio 公司，批號：PC0020）。

1.3 造模方法

40 只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后，采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組10 只和造模組30 只?？瞻讓φ战M以普通飼料喂養(yǎng)，造模組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4 周后禁食12 h，造模組腹腔內(nèi)注射STZ（25 mg/kg），空白對照組注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組按照原方案繼續(xù)喂養(yǎng)7 d 后，禁食12 h，取尾靜脈血，用血糖儀測定空腹血糖（FPG），以FPG≥7.8 mmo1/L 作為T2DM 模型成功與否的判斷標準［9-10］，造模組90%達到標準。3 只大鼠造模未成功，再次腹腔內(nèi)注射半劑量STZ（12.5 mg/kg），再以上述指標評估，均造模成功。造模成功后所有大鼠以普通飼料喂養(yǎng)。

1.4 動物分組與給藥方法

將造模成功的30 只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為中藥組、二甲雙胍組、模型組，每組10 只。中藥組以大黃黃連瀉心湯灌胃，按照《動物與人體的每公斤體重計量折算系數(shù)表》折算，給藥量為1 g/（100 g·d），二甲雙胍組按照18 mg/（100 g·d）以二甲雙胍灌胃，模型組、空白對照組予以等體積的生理鹽水灌胃，共4 周。實驗過程中有3 只大鼠死亡，空白對照組、中藥組及模型組各1 只，空白對照組及中藥組大鼠死亡前發(fā)現(xiàn)有鼻及口腔出血現(xiàn)象，死亡后經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)肺中有殘留液體，余臟器未見明顯異常，推測其死因可能是由灌胃手法不當引起，模型組死亡大鼠經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)胃腸高度脹氣、腸梗阻，推測為急性酮癥酸中毒所致。

1.5 標本取材與檢測

1.5.1 血糖、血脂測定 分別于藥物治療前、治療4 周后，禁食12 h，取各組大鼠尾靜脈血，用血糖儀測定FPG。實驗結束后，所有大鼠禁食12 h，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉、處死，腹主動脈取血，離心機3000 r/min，離心10 min，離心半徑8 cm，分離出血清，送至內(nèi)蒙古醫(yī)科大學分子生物學研究中心，-70℃冰箱保存。ELISA 法檢測FPG、TC、TG、LDL-C。

1.5.2 胰腺組織病理學觀察 實驗結束后，切取胰腺組織，浸泡于10%的甲醛溶液中固定，后送至內(nèi)蒙古醫(yī)科大學分子病理學實驗室。胰腺組織沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡透明，浸蠟包埋，切片烘干，切片厚度4 μm，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。經(jīng)脫臘，水化，HE 染色，脫水，透明后封固，于光鏡下觀察胰腺組織細胞形態(tài)，顯微攝影。

1.5.3 RT-PCR 檢測 實驗結束后，所有大鼠取右后肢大腿骨骼肌，保于液氮中冷卻30 min，送至內(nèi)蒙古醫(yī)科大學分子生物學研究中心，-80℃冰箱保存，進行骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 檢測。所有大鼠各稱取60 mg 骨骼肌，研磨、冷卻后，加入Trizol溶液裂解，提取RNA，用紫外分光光度計測定RNA 濃度，光密度（OD）260 與OD280 比值在1.8～2.0 之間，以2 μg 的RNA 為基本模板量，應用PrimeScript RT試劑盒，將RNA 逆轉錄出cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參，加入AMPKα、PGC-1α、GLUT4 上下游引物，配置PCR擴增體系，反應條件為：94℃×2 min，94℃×2 s，50℃×2 s，72℃×2 s，共40 個循環(huán)，每個樣本重復3 次，用2-ΔΔCt數(shù)值來分析AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表達量。見表1。

表1 AMPKα、PGC-1α、GLUT4 引物序列表

1.5.4 Western blot 檢測 測定骨骼肌中AMPKα、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（P-AMPKα）、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達量。所有大鼠各取稱取50 mg 骨骼肌，RIPA 細胞裂解液裂解提取蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白含量后，每組各取50 μg，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素（NC）膜，之后孵一抗Phospho-AMPKα 抗體（1 ∶1000）、AMPKα 抗體（1 ∶1000）、PCG-1α 抗體（1∶1000）、GLUT4 抗體（1∶1000）及內(nèi)參GAPDH 抗體（1∶800），4℃反應過夜，TBS-T 漂洗后，相應二抗工作液（1∶800）37℃孵育，TBS-T 漂洗，使用ECL 發(fā)光顯色液曝光，壓片，顯影并定影，掃描儀掃描圖片，用Image J軟件分析每個條帶的熒光強度值，每組實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組治療前后尾靜脈FPG 比較

造模后，造模組FPG 顯著高于空白對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；中藥組、二甲雙胍組治療后FPG 較治療前顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 各組治療前后尾靜脈FPG 的比較（mmol/L，）

表2 各組治療前后尾靜脈FPG 的比較（mmol/L，）

注：與空白對照組治療前比較，#P ＜0.01。FPG：空腹血糖

2.2 各組治療后FPG、TC、TG、LDL-C 比較

與空白對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C 均顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。與模型組比較，治療后中藥組及二甲雙胍組FPG、TC、TG、LDL-C 均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。中藥組與二甲雙胍組FPG、TC、TG、LDL-C 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 各組治療后FPG、TC、TG、LDL-C 比較（mmol/L，）

表3 各組治療后FPG、TC、TG、LDL-C 比較（mmol/L，）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。FPG：空腹血糖；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

2.3 胰腺組織病理學觀察

空白對照組：胰島β 細胞數(shù)量多，呈團索狀分布，結構完整，細胞邊界清楚，胞漿豐富，細胞核清晰可見；模型組：胰島β 細胞數(shù)量減少，外形較小，胞漿少，細胞核致密、溶解，出現(xiàn)透明樣變，部分細胞出現(xiàn)空泡樣變性。與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組胰島結構較完整，胰島β 細胞數(shù)量有所增加，空泡細胞減少，細胞變性程度較輕，細胞核清晰可見。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺HE 染色表現(xiàn)（400×）

2.4 各組AMPKα、PGC-1α、GLUT4的mRNA表達比較

與空白對照組比較，模型組大鼠骨骼肌中AMPKα、GLUT4 及PGC-1α 的mRAN 表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與模型組比較，中藥組PGC-1α、GLUT4 及AMPKα 的mRAN 表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；二甲雙胍組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRAN 表達量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；中藥組與二甲雙胍組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRAN 表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表4。

2.5 各組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4、GAPDH蛋白表達水平比較

與空白對照組比較，模型組大鼠骨骼肌中PAMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；與模型組比較，中藥組P-AMPKα、PGC-1α、GLUT4 及AMPKα 蛋白表達量顯著增高（P ＜0.05 或P ＜0.01）；二甲雙胍組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達量顯著增高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。中藥組與二甲雙胍組，AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。中藥組、二甲雙胍組P-AMPKα/ AMPKα 顯著高于模型組（P ＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。見表5、圖2。

表4 各組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表達比較（）

表4 各組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表達比較（）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α；PGC-1α：過氧化物酶體增殖活化受體γ 共激活因子-1α；GLUT4：葡萄糖轉運蛋白4

表5 各組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達水平的比較（）

表5 各組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達水平的比較（）

注：與空白對照組比較，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。P-AMPKα：磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α；AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α；PGC-1α：過氧化物酶體增殖活化受體γ 共激活因子-1α；GLUT4：葡萄糖轉運蛋白4

圖2 各組AMPKα、P-AMPKα、PGC-1α、GLUT4、GAPDH 蛋白表達水平

3 討論

T2DM 的主要發(fā)病機制為胰島素抵抗和胰島素分泌障礙，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，高血糖和脂代謝紊亂又進一步降低胰島素敏感性，并損傷胰島β 細胞功能，這是T2DM 發(fā)病機制中最重要的獲得性因素。研究發(fā)現(xiàn)，糖脂代謝紊亂與體內(nèi)多種代謝相關信號轉導機制有密切關系，由于AMPK 信號通路對糖脂代謝起全方位的調(diào)控作用，能夠增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取和代謝，增加脂肪酸氧化及減少三酰甘油合成，增加胰島素敏感性［11-12］，因此，AMPK 一直是DM研究中的重要靶點。

AMPK 作為能量調(diào)節(jié)的關鍵因子，在細胞內(nèi)AMP/ATP 比值升高、上游蛋白激酶等多因素的作用下被激活，使AMPK 具有活性，AMPK 被激活的標志是α 亞基第172 位蘇氨酸（Thr172）的磷酸化，磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（P-AMPK）通過磷酸化下游的一系列酶類底物，來調(diào)節(jié)糖脂代謝［13］。PGC-1α 是AMPK 下游的靶分子，AMPK 能夠促進PGC-1α 磷酸化水平，增加它的表達量，來調(diào)控葡萄糖代謝、脂肪酸氧化及減少氧化應激等［14］。骨胳肌是攝取和消耗葡萄糖的主要外周組織，葡萄糖進入骨胳肌細胞需要細胞膜上的GLUT4 直接參與，激活的AMPK 使GLUT4 從囊泡轉運至細胞膜，囊泡與細胞膜融合，才能使被插入細胞膜的GLUT4 用于轉運葡萄糖，促進葡萄糖的攝取量快速增加，降低血糖，因此，P-AMPK 能夠增加GLUT4 的轉位，進而增強肌肉對胰島素的反應［15］。同時，PGC-1α 又通過激活GLUT4 的上游調(diào)控子MEF2C，高效誘導GLUT4 的基因表達，使骨骼肌細胞轉運葡萄糖的能力進一步提高［16］。二甲雙胍作為治療T2DM的一線用藥，是AMPK 信號通路的激活劑。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過抑制線粒體復合物I，降低ATP，升高AMP，來激活AMPK，抑制糖異生，降低血漿游離脂肪酸，增加胰島素分泌；通過增加肌肉中GLUT4 的轉位，促進葡萄糖的攝?。煌ㄟ^上調(diào)線粒體中PGC-1α 的基因表達，增加胰島素敏感性，來降低血糖［17-20］。

DM 中醫(yī)學稱之為消渴，主要病機為氣陰兩虛、燥熱內(nèi)盛，由于熱傷氣陰，致使熱毒濁邪聚生，瘀阻血絡，火熱邪氣是DM 的基本致病因素和重要病理機制［21-23］，因此，本研究確立了清熱、化瘀、解毒的治法。大黃黃連瀉心湯中大黃能夠清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)，黃連、黃芩能夠清熱燥濕、瀉火解毒。本課題組在前期的臨床中應用大黃黃連瀉心湯治療T2DM，發(fā)現(xiàn)患者口干多飲、多食、四肢麻木等癥狀減輕，血糖、血脂明顯降低，具有較好的臨床療效［24］。本研究采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ 法構建T2DM 大鼠模型，造模后所有大鼠的FPG 均顯著高于空白對照組，說明造模成功，證明此方法制備T2DM 大鼠模型可行。模型組大鼠胰島β 細胞數(shù)量減少，細胞透明樣變，F(xiàn)PG、TC、TG、LDL-C 明顯高于空白對照組，經(jīng)大黃黃連瀉心湯治療后，大鼠胰島β 細胞數(shù)量有所增加，細胞變性程度較輕，空泡細胞減少，檢測FPG、TC、TG、LDL-C 顯著降低，說明大黃黃連瀉心湯能夠降低血糖、血脂，對胰島β 細胞具有修復和保護作用，與課題組前期的臨床觀察一致，證實了大黃黃連瀉心湯對糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用。中藥組與二甲雙胍組比較，F(xiàn)PG、TC、TG、LDL-C 無顯著差異，說明大黃黃連瀉心湯降糖、降脂療效確切，為臨床應用提供了實驗依據(jù)。

本實驗研究結果顯示，發(fā)生DM 時，骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 及蛋白表達量減少，P-AMPKα/AMPKα 比值降低，說明骨骼肌細胞中AMPK 磷酸化受到抑制，AMPKα 活性顯著降低，抑制了GLUT4、PGC-1α 表達，使葡萄糖轉運受阻，出現(xiàn)胰島素調(diào)節(jié)障礙，血糖升高，這可能是外周組織出現(xiàn)胰島素抵抗的原因之一。本實驗應用大黃黃連瀉心湯治療后，骨骼肌中P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4的mRNA 及蛋白表達量增加，P-AMPKα/AMPKα 比值增高，與二甲雙胍組比較，結果一致，提示大黃黃連瀉心湯對糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用與二甲雙胍一致，也與AMPK 信號通路相關，也是通過提高AMPK 磷酸化水平，激活AMPK，上調(diào)PGC-1α 和GLUT4 的表達，來降低血糖，這是其降糖、降脂作用機制的一個方面，AMPK 信號通路并不是大黃黃連瀉心湯調(diào)節(jié)血糖代謝的唯一通路，發(fā)現(xiàn)其可能作用的其他信號通路并明確作用靶點，還有待于進一步研究。AMPKα 與GLUT4、PGC-1α 這兩個因子并不是完全獨立的，而是彼此聯(lián)系。AMPKα 可誘導PGC-1α、GLUT4 基因表達，PGC-1α 又可以調(diào)控GLUT4 的表達量，三者協(xié)同作用，使骨骼肌細胞轉運葡萄糖的能力提高。本實驗中應用大黃黃連瀉心湯治療后，RT-PCR 和Western blot 的結果趨勢一致，AMPKα、GLUT4、PGC-1α 表達量均增加，說明基因表達量的變化，經(jīng)轉錄、翻譯，引起了蛋白表達量相應的變化。

綜上所述，大黃黃連瀉心湯在T2DM 大鼠模型中應用，降糖、降脂效果明顯，對胰島β 細胞具有修復和保護作用，其降糖機制與AMPK 信號通路相關，通過激活AMPKα，增加PGC-1α、GLUT4 的表達，進而調(diào)節(jié)糖脂代謝。本實驗為大黃黃連瀉心湯的臨床應用提供了理論依據(jù)，它可能作為AMPK 信號通路的激活劑，為T2DM 的預防和治療提供新思路。