陳洪福 張 慧 梅鵬金 聶 耳

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 徐州 221004

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是目前已知發(fā)病率最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，常規(guī)手術(shù)后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者補(bǔ)充放療和化療。雖然診斷和治療策略正在取得進(jìn)展，但在大多數(shù)情況下，中位生存時(shí)間不到1 a。膠質(zhì)瘤患者的5 a生存率是所有癌癥中最低的[1-2]。然而，腦膠瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)和分子機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探索為膠質(zhì)瘤的治療提供新的治療靶點(diǎn)[3]。CHIP (Hsc70羧基末端相互作用蛋白)是U-box E3泛素連接酶。最近，發(fā)現(xiàn)U-box E3酶CHIP可促進(jìn)或抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[4-5]。迄今為止，CHIP在腦膠質(zhì)瘤中的確切功能和潛在機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用過(guò)表達(dá)CHIP質(zhì)粒，研究其對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251系周期和凋亡的影響，探索其在膠質(zhì)瘤中的確切功能。

1 材料與方法

1．1材料腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251在實(shí)驗(yàn)室凍存，pcDNA3.1空載質(zhì)粒、pcDNA3.1-CHIP質(zhì)粒由江蘇省腫瘤生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，使用的是Thermo集團(tuán)提供的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，四季青集團(tuán)提供的胎牛血清，碧云天集團(tuán)提供的含量為0.25%胰酶溶液，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)公司)，CHIP一抗(Santa Cruz公司)，β-action一抗(Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG(北京中杉公司)。

1．2細(xì)胞培養(yǎng)及分組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶(2～3 d)傳代。本實(shí)驗(yàn)的所有指標(biāo)測(cè)試如下：CHIP OE組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CHIP質(zhì)粒)、CHIP Ctrl組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒)。

1．3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染CHIP OE、CHIP Ctrl質(zhì)粒(60 mm小皿)在其生長(zhǎng)約90%融合時(shí)，并嚴(yán)格依據(jù)Lipofectamine 2000中的操作指南來(lái)做，然后針對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本做分類。

1．4Westernblot實(shí)驗(yàn)主要是針對(duì)CHIP蛋白進(jìn)行操作，需要將其先進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理48 h然后取出，并將其所產(chǎn)生的細(xì)胞匯總，加入RIPA裂解液里，確保其溫度控制在4 ℃，以每分鐘15 000 g的速度做離心處理15 min，將其溶液中的清液用滴管提取出來(lái)，設(shè)定其是實(shí)驗(yàn)的總蛋白；然后需要5個(gè)蛋白緩沖液，放置在100 ℃的純凈水中5 min使其性狀發(fā)生改變；用含量為10%的SDS-PAGE溶液進(jìn)行分離處理，并將其放置在NC膜表面進(jìn)行觀察；配置比例為1：500的免抗人CHIP跟β-actin抗體溶液，將其溫度控制在4 ℃，然后靜置一夜；用洗滌緩沖液進(jìn)行反復(fù)沖洗，5 min/次，需要沖洗3次，然后添加溶度為0.1%的二抗，放置在常溫的環(huán)境下2 h；做BCIP /NBT顯色對(duì)比實(shí)驗(yàn)。然后通過(guò)image J程序?qū)ζ洳煌叶戎档腃HIP蛋白的情況進(jìn)行分析。

1．5流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞周期變化0.25%胰酶消化CHIP OE、CHIP Ctrl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，然后將其以每分鐘2 000轉(zhuǎn)的速度進(jìn)行離心處理5 min。再將其含量調(diào)整到1×106/mL留作備用；然后在4℃下，用70%乙醇固定過(guò)夜；第2天，通過(guò)離心收集細(xì)胞，用預(yù)先冷卻的PBS洗滌細(xì)胞2遍，小心吸出上清并保留，可以殘留50 μL左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)；加100 μL RNase A 溶液，放置在37℃的水中半小時(shí)；然后需要添加400 μL的PI溶液進(jìn)行染色處理并將其攪拌均勻，在無(wú)光照的環(huán)境下，將其溫度控制在4 ℃靜置半小時(shí)；然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．6流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞凋亡變化0.25%胰酶消化CHIP OE、CHIP Ctrl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取 5×105～1×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min，在4 ℃下，離心10 min，棄去上清；加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸??；1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，重復(fù)2次；將細(xì)胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液上；添加10 μL的膜聯(lián)蛋白V-FITC溶液搖勻，在常溫的環(huán)境下遮光處理15 min；添加300 μL的結(jié)合緩沖液和5 μL PI，然后使用流式設(shè)備對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果

2．1Westernblot分析CHIP蛋白的表達(dá)情況測(cè)定2組蛋白條帶(圖1)的灰度值。結(jié)果顯示：CHIP Ctrl組的CHIP蛋白表達(dá)(0.089±0.012)較CHIP OE組(0.912±0.013)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明成功轉(zhuǎn)染CHIP OE質(zhì)粒，可顯著提高CHIP/STUB1基因的表達(dá)水平。

2．2流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251周期變化結(jié)果CHIP OE質(zhì)粒顯著改變腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞周期，G0/G1期所占比例增加，S、G2/M期所占比例減少，與CHIP Ctrl 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。CHIP OE組、CHIP Ctrl 組，G0/G1、S、G2/M各期所占比例統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2。

表1過(guò)表達(dá)CHIP對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251周期的影響

Table1EffectofoverexpressionofCHIPonU251cycleofgliomacells

注：與對(duì)照組(CHIP Ctrl)相比，*P<0.001，**P<0.01，***P<0.05

注：與對(duì)照組(CHIP Ctrl)相比，*P<0.001，**P<0.01，***P<0.05圖2 過(guò)表達(dá)CHIP對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251周期的影響統(tǒng)計(jì)圖Figure 2 Statistical analysis of the effect of overexpression of CHIP on glioma cell U251 cycle

2．3流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡變化結(jié)果CHIP Ctrl組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率(12.13 ±0.87)%，CHIP OE組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率(22.83±1.38)%，過(guò)表達(dá)CHIP增加腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡率(圖3右上、右下象限為凋亡細(xì)胞)，與CHIP Ctrl 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖3、4。

圖3 過(guò)表達(dá)CHIP對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡的影響Figure 3 Effect of overexpression of CHIP on apoptosis of glioma cell line U251

注：與對(duì)照組(CHIP Ctrl)相比，*P<0.001圖4 過(guò)表達(dá)CHIP對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡的影響統(tǒng)計(jì)圖Figure 4 Effect of overexpression of CHIP on apoptosis of glioma cell line U251

3 討論

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤作為神經(jīng)外科疾病中常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管有手術(shù)、放療及化療等綜合治療方法，但臨床效果并不滿意，其仍然以生存率低、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)被認(rèn)為是神經(jīng)外科的難題之一。膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤蛋白的研究將為膠質(zhì)瘤的治療，提供新的治療靶點(diǎn)。CHIP是BALLINGER等[6]在用親環(huán)素40(CyP40)包含TPR(tetratricopeptide repeat)中的某些片段信息的蛋白質(zhì)，這種新型的蛋白質(zhì)，由于可以和Carboxyl end of heat shock protein反應(yīng)稱之為CHIP，其分子量約35 kD。研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在早期腫瘤轉(zhuǎn)化為侵襲性惡性腫瘤中起關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄因子Snail是一種極不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其亞細(xì)胞水平受許多E3泛素連接酶調(diào)節(jié)，促進(jìn)EMT以及相關(guān)的病理特征，包括遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。Hsc70相互作用蛋白(CHIP)的羧基末端作為一種新型Snail泛素連接酶，其與Snail相互作用以誘導(dǎo)泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。抑制CHIP表達(dá)增加Snail蛋白水平，誘導(dǎo)EMT并增強(qiáng)體外遷移和侵襲以及卵巢癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移[7]。SHANG等發(fā)現(xiàn)U-box E3連接酶通過(guò)抑制有氧糖酵解抑制卵巢癌的腫瘤進(jìn)展。CHIP的誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制。相反，CHIP的消耗導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)。CHIP的消耗或敲除增加了腫瘤和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的糖酵解產(chǎn)物。同時(shí)，其發(fā)現(xiàn)CHIP表達(dá)與人卵巢癌中的PKM2水平呈負(fù)相關(guān)[8]。此研究結(jié)果與我們前期在腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的報(bào)告結(jié)果差不多。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHIP可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，也可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。PAUL等[5]研究發(fā)現(xiàn)CHIP與c-Myc相互作用并泛素化，從而將其靶向蛋白酶體介導(dǎo)的降解。過(guò)表達(dá)CHIP可加速c-Myc蛋白的轉(zhuǎn)換率。相反，通過(guò)RNAi敲除CHIP可穩(wěn)定內(nèi)源性c-Myc。CHIP跟c-Myc兩者的關(guān)系跟分子伴侶有關(guān)。并且由于c-Myc細(xì)胞的活性，可以在一定程度上降低癌細(xì)胞的活性。研究[4]認(rèn)為，CHIP的增加與膠質(zhì)瘤分級(jí)高相關(guān)，伴隨著高級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Ki-67表達(dá)的增加。在正常腦中，CHIP主要在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。調(diào)節(jié)CHIP水平可能是膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵決定因素。 CHIP的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)體外U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖和集落形成，而CHIP RNAi可以獲得相反的結(jié)果。此外，在腫瘤內(nèi)注射含有CHIP shRNA的慢病毒后，異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢，而在瘤內(nèi)注射CHIP過(guò)表達(dá)的慢病毒后檢測(cè)到腫瘤生長(zhǎng)的增強(qiáng)。這些結(jié)果表明CHIP是體外和體內(nèi)腫瘤發(fā)生所必需的，并可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤的腫瘤發(fā)生，發(fā)現(xiàn)CHIP調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的變化是可以利用存活素來(lái)進(jìn)行觀察的。

由于現(xiàn)階段針對(duì)CHIP的研究并不完善，沒(méi)有針對(duì)不同的腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此其致癌和抑癌情況還需要做更深一步的研究[9-40]。

根據(jù)本課題實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容表明，由于pcDNA3.1-CHIP可以對(duì)U251細(xì)胞進(jìn)行染色，所以其具有一定的有效表達(dá)，然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，查看其CHIP蛋白形成融合蛋白并且較對(duì)照組表達(dá)量明顯增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果示，CHIP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒阻礙腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 G0/G1期進(jìn)展，出現(xiàn)G0/G1期停滯現(xiàn)象，其機(jī)制可能與CHIP過(guò)表達(dá)減少Snail蛋白水平，導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解減少，抑制EMT從而出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象有關(guān)[7]，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，WinMDI軟件分析數(shù)據(jù)結(jié)果示，CHIP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；本課題的內(nèi)容跟Paul的報(bào)告內(nèi)容差不多，亦或過(guò)表達(dá)E3連接酶通過(guò)抑制有氧糖酵解，從而促進(jìn)凋亡，因CHIP有兩個(gè)主要功能結(jié)構(gòu)域，TPR結(jié)構(gòu)域和U-box結(jié)構(gòu)域[6，8]，這是其功能復(fù)雜性所在，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，CHIP在治療腦膠質(zhì)瘤的過(guò)程中，其產(chǎn)生的效果非常明顯，可以作為后續(xù)臨床醫(yī)療的依據(jù)作為參考，并為該領(lǐng)域的靶向治療方案提供一定的價(jià)值。