邢 英，梅彩霞2，瑪依拉·卡哈爾，李雅麗

肥胖是一種多因素引起的慢性代謝性疾病，表現(xiàn)為體內(nèi)脂肪堆積過多，體重增加[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改善，肥胖發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有3 億人患有肥胖，占全球人口7%以上[2]。中國成人超重率為22.8%，肥胖率為7.1%[3]。肥胖是許多慢性疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈硬化等的主要危險(xiǎn)因素，已經(jīng)成為威脅人類健康的殺手之一[4-5]。脂肪組織是人體重要的儲(chǔ)能組織，脂肪細(xì)胞出現(xiàn)增殖和分化的異常，將會(huì)引發(fā)脂肪肝、代謝綜合征和心血管疾病等。因此，干預(yù)脂肪細(xì)胞增殖和分化成為防治上述疾病的關(guān)鍵[6]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)及其相關(guān)藥物，因具有改善胰島素抵抗、降低體重、改善脂代謝等作用，越來越多地被應(yīng)用于肥胖等相關(guān)疾病的治療中[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可能通過上調(diào)血清脂聯(lián)素水平，改善糖脂代謝，進(jìn)而使機(jī)體胰島素敏感性增加[8-9]。本研究運(yùn)用GLP-1干預(yù) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞，觀察其對脂肪細(xì)胞增殖以及脂聯(lián)素的影響，為闡明GLP-1對肥胖過程影響提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞系(ATCC品牌)，GLP-1、胰島素(INSULIN)、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購自美國Sigma公司，高糖培養(yǎng)基(DMEM，Hyclon 公司)，10%胎牛血清(FBS，Hyclon公司)，二甲基亞砜(DMSO)購自中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞系加入含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到完全融合，48 h后開始誘導(dǎo)，換誘導(dǎo)劑Ⅰ：98.74 mL(90%DMEM+10%FBS)，1 mL IBMX(終濃度0.5 mmol/L)，161 μL INSULIN(850 nmol/L)，100 μL Dex(1 μmol/L)。3 d后換誘導(dǎo)劑Ⅱ：99.84 mL(90%DMEM+10%FBS)，161 μL胰島素(850 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，至第8天，約90%的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型時(shí)行下一步處理。

1.2.2 試驗(yàn)分組及處理 將誘導(dǎo)成功的3T3-L1前脂肪細(xì)胞以濃度0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的GLP-1作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞，共同培養(yǎng)至第8天，在培養(yǎng)第2天、第4天、第6天、第8天收集細(xì)胞備用，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)比色法測定GLP-l對細(xì)胞增殖的影響 3T3-L1前脂肪細(xì)胞以1×104/mL，每孔100 N，4復(fù)孔接種于96孔培養(yǎng)板，在37.5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，觀察見細(xì)胞已貼壁。設(shè)對照組(0 nmol/L)和干預(yù)組(分別加入終濃度1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的GLP-1)，細(xì)胞共培養(yǎng)8 d，每24 h更換含藥培養(yǎng)液1次。第2天、第4天、第6天、第8天經(jīng)CCK-8比色法應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度(OD)值以代表活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中脂聯(lián)素含量 在上述實(shí)驗(yàn)步驟基礎(chǔ)上，第2天、第4天、第6天、第8天經(jīng)ELISA法測定細(xì)胞上清液中脂聯(lián)素含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 倒置顯微鏡下觀察：誘導(dǎo)分化前，3T3-L1細(xì)胞呈梭形，胞漿內(nèi)無脂滴，表現(xiàn)為纖維母樣的前脂肪細(xì)胞形態(tài)(圈)。誘導(dǎo)分化4 d后細(xì)胞變大、變圓，部分細(xì)胞中出現(xiàn)分散的細(xì)小脂滴；誘導(dǎo)8 d后，80%左右細(xì)胞均分化為成熟脂肪細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞進(jìn)一步增大，呈圓形，胞漿內(nèi)含有大量脂滴，脂滴聚集于核周，形成“戒環(huán)”樣形態(tài)。結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 誘導(dǎo)第0天3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)(×20)

圖2 誘導(dǎo)第4天3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)(×20)

圖3 誘導(dǎo)第8天3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)(×20)

2.2 不同濃度GLP-1作用不同時(shí)間對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 應(yīng)用不同濃度GLP-1干預(yù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖過程，干預(yù)第4天，100nmol/L、1 000 nmol/L較0 nmol/L細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)；第6天，100 nmol/L、1 000 nmol/L較0 nmol/L細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)；第8天，隨著GLP-1干預(yù)濃度的增長，細(xì)胞數(shù)量較0 nmol/L明顯降低(P<0.05或P<0.01)。以上結(jié)果顯示，高濃度長時(shí)間GLP-1干預(yù)對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯。詳見表1。

表1 不同濃度GLP-1對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響(OD值)(±s)

與同時(shí)間0 nmol/L比較，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 不同濃度GLP-1作用不同時(shí)間對3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中脂聯(lián)素含量的影響 隨著GLP-1濃度的逐漸增高，3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中脂聯(lián)素含量逐漸升高，呈一定的濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)。在相同濃度GLP-1干預(yù)下，隨著作用時(shí)間的延長，脂聯(lián)素的含量也逐漸升高。詳見表2。

表2 不同濃度GLP-1對3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中脂聯(lián)素含量的影響(±s) mg/L

與同時(shí)間0 nmol/L比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

近年來，脂肪細(xì)胞分化調(diào)控及其與肥胖、胰島素抵抗的關(guān)系一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。脂肪組織是一個(gè)新型的內(nèi)分泌組織，其分泌的許多脂肪細(xì)胞因子對維持體內(nèi)代謝平衡有著重要作用。3T3-L前脂肪細(xì)胞功能與之相似，廣泛應(yīng)用于脂肪細(xì)胞增殖、分化和分化過程中基因表達(dá)調(diào)控的研究領(lǐng)域，也是研究減肥降脂降糖藥物及其作用機(jī)制的一個(gè)方向[10]。GLP-1是一種腸促胰島素，和胰島細(xì)胞分泌的胰高血糖素一樣源于胰高血糖素原基因，在外周主要以肽的有效形式通過多種途徑發(fā)揮抗肥胖和其他代謝性疾病的作用[11]。

本研究以3T3-L1前體脂肪細(xì)胞為研究對象，探討GLP-1對其增殖的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLP-1對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響隨不同濃度、不同作用時(shí)間有所不同。主要趨勢為隨著干預(yù)時(shí)間的延長，其對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且有劑量依賴關(guān)系。本研究中GLP-1濃度為1 000 nmol/L干預(yù)第8天時(shí)對3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)。

脂聯(lián)素是一種由244個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[12]，是一種幾乎全部由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，也是唯一一個(gè)分泌量與脂肪細(xì)胞體積呈反比的脂肪因子，具有改善外周和肝臟胰島素抵抗的作用。因此，本研究進(jìn)一步探討不同濃度GLP-1作用時(shí)間對3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中脂聯(lián)素含量的影響。結(jié)果顯示，GLP-1可升高培養(yǎng)基中脂聯(lián)素的含量，其趨勢表現(xiàn)為隨著GLP-1濃度的逐漸增高，3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中脂聯(lián)素含量逐漸升高，呈一定的濃度依賴性且在相同濃度GLP-1干預(yù)下，隨著作用時(shí)間的延長，脂聯(lián)素的含量也逐漸升高。這些結(jié)果初步表明，GLP-1可明顯增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的含量，可能是其抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。以往的研究表明脂聯(lián)素通過與AdipoR1和AdipoR2結(jié)合后，分別激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和過氧化酶體增殖物激活受體α(PPARα)途徑減少脂肪酸合成，從而減少脂肪的儲(chǔ)存而發(fā)揮作用[13-14]。因此，GLP-1抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述， GLP-1可抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖并升高脂聯(lián)素含量，為臨床使用GLP-1干預(yù)肥胖癥提供了可能，但其作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。