崔利萍，崔艷花2，劉曉東3，周 麗，劉玉潔

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由嗜心肌病毒感染心肌引起的心肌炎癥性疾病，以心肌細(xì)胞變形及壞死或間質(zhì)性炎癥為主要特征，位于兒科心肌炎的首位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。腸道柯薩奇病毒B(CVB)是引起病毒性心肌炎的主要病原，流行病學(xué)研究顯示，病毒性心肌炎病人常有近期CVB 感染[2]。病毒性心肌炎尚無有效且系統(tǒng)的治療方法，逐步引起了醫(yī)務(wù)人員的重視。經(jīng)典方劑清營湯具有清營解毒、滋陰透熱之功效，現(xiàn)代常用于乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、膿毒癥等急性感染性疾病[3]。本研究通過柯薩奇病毒B3(CVB3)感染小鼠建立病毒性心肌炎模型，探討清營湯對病毒性心肌炎小鼠死亡率、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及心肌組織中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、IGF-1受體(IGF-1R)表達(dá)的影響，為臨床防治病毒性心肌炎提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只近交系BALB/c 雄性小鼠，4周齡，體重16～18 g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清營湯：水牛角30 g，生地黃15 g，玄參9 g，竹葉3 g，麥冬9 g，丹參6 g，黃連5 g，金銀花9 g，連翹6 g。按方劑比例稱取藥材適量，加10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，調(diào)整濃度為相當(dāng)于生藥1.05 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器 CVB3病毒液由鄭州大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室惠贈，病毒液組織培養(yǎng)半數(shù)感染量為100 TCID50/0.1 mL；CK-MB、AST、LDH、IL-6、IL-10、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；IGF-1、IGF-1R單克隆抗體購自Santa Cruz公司；ELX-800型酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)；T10型高速組織勻漿機(jī)(德國IKA公司)；RM2245型病理切片機(jī)(德國Leica公司)；CX31型顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與分組給藥 60只BALB/c小鼠按體重隨機(jī)分為正常對照組、模型組和治療組，每組20只。模型組和治療組小鼠每只按0.1 mL腹腔注射CVB3 病毒100 TCID50/0.1 mL的CVB3病毒液0.1 mL，連續(xù)注射3 d建立小鼠病毒性心肌炎模型[4]。正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水。首次注射病毒液2 h后開始灌胃給藥，治療組灌胃清營湯21.0 g/kg，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)14 d。

1.4.2 小鼠一般狀況和死亡率 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠的一般情況，記錄小鼠死亡情況，計算各組死亡率。

1.4.3 血清心肌酶和炎癥因子檢測 末次給藥后小鼠禁食禁水12 h后稱重，眼動脈叢取血，4 000 r/min離心5 min，取上清，按照試劑盒說明書采用ELISA法分析血清中CK-MB、AST、LDH的活性和IL-6、IL-10、TNF-α的含量。

1.4.4 心肌組織病理學(xué)變化 小鼠取血后分離心臟，取心臟用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察心肌病理學(xué)改變。

1.4.5 Western Blot檢測心肌組織中IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá) 取100 mg心肌組織提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品變性，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，奶粉封閉后漂洗，加IGF-1(1∶500)一抗或IGF-1R(1∶800)一抗孵育過夜，漂洗后以滴加二抗室溫孵育2 h，漂洗后在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值的比值作為蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠一般狀況、死亡率和心臟指數(shù)比較 正常對照組小鼠實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)食、活動等正常，毛色光澤，反應(yīng)靈敏，體重正常，實(shí)驗(yàn)期間小鼠未見死亡；模型組小鼠攝食量和活動減少，聳毛蜷縮，毛發(fā)無光澤，對刺激反應(yīng)遲鈍，消瘦，實(shí)驗(yàn)期間死亡8只(死亡率40%)；治療組小鼠一般情況較模型組明顯改善，實(shí)驗(yàn)期間死亡3只(死亡率15%)。3組小鼠死亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3組小鼠心肌酶水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠血清CK-MB、AST和LDH水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組小鼠血清CK-MB、AST和LDH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組小鼠血清CK-MB、AST和LDH水平比較(±s) U/L

1) 與正常對照組比較，P<0.05；2) 與模型組比較，P<0.05

2.3 3組小鼠血清炎癥因子水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠血清IL-6和TNF-α水平升高，IL-10含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組小鼠血清IL-6和TNF-α水平下降，IL-10含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組小鼠血清IL-6、IL-10和TNF-α水平比較(±s) ng/L

1) 與正常對照組比較，P<0.05；2) 與模型組比較，P<0.05

2.4 3組小鼠心肌病理改變比較 正常對照組小鼠心肌未見病理改變；模型組小鼠心肌組織心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)水腫，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，并伴有多灶性壞死；治療組小鼠病理病變程度相對模型組有所改善。詳見圖1。

圖1 3組小鼠心肌病理組織學(xué)情況(HE染色，×200)

2.5 3組小鼠心肌組織中IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組心肌組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組心肌組織中IGF-1、IGF-1R表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

與正常組比較，※ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05圖2 3組小鼠心肌組織中IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

病毒性心肌炎是由病毒感染心肌所致的心肌及其間質(zhì)局限或彌漫性炎癥，是臨床常見的心血管系統(tǒng)疾病，在兒童和青少年中的發(fā)病率有逐年上升趨勢。病毒性心肌炎具有較高的危害性，部分病人病情遷延，可遺留頑固性心律失常、慢性心功能不全及擴(kuò)張性心肌病。目前已發(fā)現(xiàn)引起該病的病毒有30 余種，其中最主要的是CVB[5]。BALB/c小鼠心肌細(xì)胞表面有特異性CVB受體，感染嗜心性CVB3 后導(dǎo)致心肌炎[6]。本研究采用3次腹腔注射CVB誘導(dǎo)病毒性心肌炎模型，病毒感染后小鼠死亡率為40%，心肌病理組織發(fā)生明顯改變，血清中心肌酶水平顯著升高，提示小鼠患病毒性心肌炎，與相關(guān)報道一致。

病毒性心肌炎的臨床治療以抗病毒藥物、維生素及對癥治療為主，其目的是保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制異常免疫，改善心肌代謝，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心功能[7-8]。西藥的抗病毒效果并不穩(wěn)定，大量研究表明中藥對病毒性心肌炎有良好的治療作用。清營湯具有清營解毒、滋陰透熱之功效，用于溫病營分證的治療，現(xiàn)代常用于急性感染性疾病，如乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、膿毒癥等。本研究結(jié)果顯示，清營湯可降低病毒性心肌炎小鼠的死亡率，改善心肌組織病理學(xué)改變，降低血清中心肌酶水平，調(diào)節(jié)炎癥因子的平衡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

CK-MB通常存在于動物的心臟、肌肉等組織的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，健康人血清中CK-MB含量較低[9]，當(dāng)心肌細(xì)胞受損，膜的完整性被破壞，CK-MB通過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入血液，分析其在血清中的濃度可以提高對心肌損傷診斷的靈敏度和特異性[10]。AST和LDH作為典型的細(xì)胞內(nèi)酶，也存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，在心肌細(xì)胞發(fā)生壞死后釋放入血[11]。本研究發(fā)現(xiàn)病毒性心肌炎小鼠血清中CK-MB、AST、LDH活性明顯高于正常小鼠，清營湯可降低病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶水平。

病毒感染所誘發(fā)的免疫反應(yīng)與心肌損傷密切相關(guān)。人體內(nèi)Th 細(xì)胞分為Th1、Th2 兩類亞群，生理情況下二者保持動態(tài)平衡，維持機(jī)體免疫功能的正常發(fā)揮。當(dāng)機(jī)體接觸抗原后Th1 細(xì)胞分泌白介素-2(IL-2)、IL-6、TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)等炎癥因子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞分泌白介素-4(IL-4)、IL-10等促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[12]。病人在病毒性心肌炎早期，Th1細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量較多，主要參與心肌炎癥所致的損傷，Th2細(xì)胞在恢復(fù)期數(shù)量逐漸增多，因此，Th2細(xì)胞有助于緩解心肌炎，Th1應(yīng)答則和心肌炎發(fā)病密切相關(guān)[13-14]。本研究顯示，病毒性心肌炎小鼠血清中IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平降低，清營湯干預(yù)后心肌炎小鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，表明清營湯可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)對病毒性心肌炎產(chǎn)生保護(hù)作用。

IGF-1是一類在結(jié)構(gòu)和功能上均與胰島素相似的生長因子，心肌組織IGF-1來自血液循環(huán)和心肌自分泌。大量研究表明，IGF-1在其結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)下與其受體IGF-1R結(jié)合，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡或抑制心肌細(xì)胞凋亡，對心肌組織中存在的多能心肌干細(xì)胞有動員并促進(jìn)其增殖、分化作用，可補(bǔ)充、修復(fù)衰老或在病理狀態(tài)下死亡的心肌細(xì)胞[15]。出生后早期IGF-1促進(jìn)心臟發(fā)育，隨后其分泌逐漸減少，正常成年心肌組織處于低水平表達(dá)。正常機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于平衡狀態(tài)，但心肌感染病毒后可出現(xiàn)不同程度的炎性病變，細(xì)胞壞死，心肌功能受損，血液及心肌組織中IGF-1和IGF-1R等相關(guān)蛋白表達(dá)增加[16]，IGF-1有可能通過其抗凋亡、促細(xì)胞增殖和干細(xì)胞動員作用減少心肌受損。本研究表明，病毒性心肌炎小鼠心肌中血清IGF-1 和IGF-1R表達(dá)增加，清營湯干預(yù)后小鼠心肌中血清IGF-1和IGF-1R表達(dá)減少。

綜上所述，本研究證實(shí)了清營湯對病毒性心肌炎的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)和心肌組織中IGF-1和IGF-1R的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，但由于IGF-1對心肌細(xì)胞的影響復(fù)雜，清營湯保護(hù)病毒性心肌炎的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。