李明如，聶振凱，林貴湖，張凱華

中國航天科工集團七三一醫(yī)院胸外科，北京100074

肺腺癌是最常見的肺癌類型，也是最致命和最常見的癌癥之一[1]。肺腺癌患者的5 年總生存率僅為11%，嚴重威脅著人類健康[2]。因此，闡明肺腺癌發(fā)生的分子機制，尋找新的預后標志物和分子治療靶點，提高對人肺腺癌的診斷、預防和治療水平，已成為當務(wù)之急。ERBB4 是表皮生長因子受體家族成員，在生理和病理過程中起重要作用。但ERBB4 在癌癥中的作用仍存在爭議。長期以來，ERBB4 一直被認為是一種致癌基因，如是黑色素瘤的潛在治療靶點[3]，促進尤文氏肉瘤的轉(zhuǎn)移[4]和人乳腺癌細胞的增長[5-6]，甚至可以提高肺癌細胞的增殖潛能[7]。然而，一些研究結(jié)果卻表明ERBB4 在腫瘤中發(fā)揮著抑癌的作用，如促進乳腺癌細胞周期阻滯和凋亡[8-9]，ERBB4 缺失會促進肝細胞腫瘤的發(fā)生[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)ERBB4 的缺失通過抑制腫瘤抑制因子TP53 誘導核蛋白 1（TP53- inducible nucleoprotein 1，TP53INP1）的表達來抑制p53 基因的表達，從而促進了肝癌的發(fā)生發(fā)展[10]。本研究旨在探究ERBB4與TP53INP1 在肺腺癌中的表達作用關(guān)系，并揭示ERBB4 的表達對肺腺癌預后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

20 例腫瘤組織樣本來自在中國航天科工集團七三一醫(yī)院治療的肺腺癌患者；肺腺癌細胞系SPC-A-1、H1299 和人正常肺上皮細胞BEAS-2B購自中國科學院細胞庫，均采用RPMI-1640 培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清），于37℃、含5% CO2濕化氣氛的培養(yǎng)箱中生長；pGL3 載體購自上海康朗生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；LipofectAMINE 3000 試劑盒、TRIzol試劑購自Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa 公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑購自Promega 公司；TP53INP1、ERBB4、β-actin 及含辣根過氧化物酶的二抗購自Abcam 公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自BioRad 公司。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及過表達載體構(gòu)建

用LipofectAMINE 3000 試劑盒對H1299 細胞中的ERBB4 轉(zhuǎn)染siRNAs，分為si-ERBB4 組和si-NC 組。將PCR 擴增得到的ERBB4 基因克隆到慢病毒載體中，滴度檢測后，將成功包裝的過表達載體和陰性對照載體轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞H1299，分為oe-ERBB4 組和oe-NC 組。

1.3 數(shù)據(jù)生物信息學分析

通過Kaplan-Meier plotter 分析平臺（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service），在線分析來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的TP53INP1 和ERBB4 基因表達數(shù)據(jù)與肺腺癌生存預后的關(guān)系。

1.4 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol 試劑提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)cDNA，采用SYBR 熒光染料進行qRT-PCR。標準化為β-actin mRNA 的表達。TP53INP1 正義引物為5′-GCCTAAAGGCTACGGACTATTGC-3′，反義引物為5′-GGACCTAATCGAATGCTATTCAGA-3′；ERBB4 正義引物為5′-GTTGGCAGTCCAGCTA TGCAATAC-3′，反義引物為5′-CTATACGATACCTCCAACTAGGA-3′。實時定量PCR 反應(yīng)一式3份。基因表達的相對水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.5 Western 印跡分析

將熱變性的蛋白樣品點至SDS-PAGE 膠中，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌后，與標記有辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h，TBST 洗滌后向膜中加入化學顯色劑，反應(yīng)5 min，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像檢測。

1.6 螢光素酶報告基因檢測實驗

將含有miR-193a-3p 結(jié)合位點或突變位點的TP53INP1 或ERBB4 的3′UTR 全長序列克隆到pGL3 載體，然后用100 nmol/L 的miR-4461 模擬物或NC 模擬物轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞24 h（NC 模擬物正義引物為5′-CGACUGGUACCAAUGAAC-3′，miR-193a-3p 模擬物正義引物為5′-GCAAUGAC AAGCUUACGAAGG-3′。螢光素酶相對活性統(tǒng)一化為海腎螢光素酶活性，用雙螢光素酶報告基因檢測試劑測定。

1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖

實驗分為si-NC 組、si-ERBB4 組、si-ERBB4+miR-193a-3p 抑制劑組及si-ERBB4+oe-TP53INP1組，各組細胞以2×104/孔接種于96 孔板，每組3 個重復，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 和96 h 后加入10 μL CCK-8，1 h 后在酶標儀上測定各孔的D450nm值，以時間為橫坐標、D450nm值為縱坐標細胞制增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism 7 進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以x±s表示，2 個獨立組均值間差異采用t檢驗，3 組以上的組間比較采用方差分析法（One-Way ANOVA），組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織和細胞中的表達

為了探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表達，我們檢測了20 對肺腺癌組織和癌旁組織中ERBB4 和TP53INP1 的表達，還檢測了在肺腺癌細胞系SPC-A-1、H1299 和人類肺上皮細胞BEAS-2B 中ERBB4 和TP53INP1 的表達。如圖1A、B 所示，腫瘤組織中ERBB4、TP53INP1 的表達均比在癌旁組織中低（均為P＜0.0001)，差異具有統(tǒng)計學意義。如圖1C 所示，與人肺上皮細胞BEAS-2B相比，SPC-A-1、H1299 細胞系ERBB4 和TP53INP1表達均顯著降低（均為P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。該結(jié)果提示，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中表達均較低，且組織和細胞系具有一致性。

2.2 ERBB4/TP53INP1 的表達與肺腺癌預后相關(guān)

為了探究ERBB4/TP53INP1 表達與肺腺癌預后的關(guān)系，我們應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter 分析了ERBB4/TP53INP1 表達與肺腺癌預后的相關(guān)性。如圖2 所示，肺腺癌組織中ERBB4/TP53INP1 高表達與整體生存期（overall survival，OS）良好顯著相關(guān)，ERBB4/TP53INP1 表達越高，肺腺癌的預后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表達均可以作為肺腺癌患者整體生存率的獨立預后指標。同時這些結(jié)果也表明，ERBB4 和TP53INP1 可能在人類肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.3 ERBB4 與TP53INP1 的表達相關(guān)性分析

從上述肺腺癌組織和細胞中的ERBB4 和TP53INP1 表達結(jié)果，推測兩者在肺腺癌中的表達可能具有一定的相關(guān)性。為此我們做了進一步檢測，結(jié)果表明ERBB4 和TP53INP1 的mRNA 表達呈正相關(guān)（R2=0.7488，P＜0.0001）（圖3）。

圖1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織和細胞中的表達水平

圖2 ERBB4/TP53INP1 的表達與肺腺癌預后相關(guān)

2.4 ERBB4 沉默/過表達對TP53INP1 蛋白表達的影響

ERBB4 與TP53INP1 的mRNA 表達呈正相關(guān)，那么ERBB4 蛋白表達的增減是否影響TP53INP1的蛋白表達量呢？通過Western 印跡檢測ERBB4沉默/過表達對TP53INP1 蛋白表達的影響，結(jié)果如圖4，si-ERBB4 沉默表達，TP53INP1 的蛋白表達也明顯降低，而ERBB4 過表達時，TP53INP1 的蛋白表達量也明顯增加。該結(jié)果表明ERBB4 沉默或過表達也會影響TP53INP1 蛋白的表達。

2.5 ERBB4 通過靶向miR-193a-3p 調(diào)控TP53INP1的表達

圖3 ERBB4 與TP53INP1 的表達相關(guān)性分析

圖4 Western 印跡檢測ERBB4 沉默/過表達對TP53INP1 蛋白表達的影響

無論mRNA 還是蛋白表達，ERBB4 和TP53INP1 都呈現(xiàn)密切的相關(guān)性。為了探究其中的聯(lián)系，我們通過starBase 靶向預測了ERBB4 和TP53INP1 的3′UTR 均有miR-193a-3p 的結(jié)合位點，并采用肺腺癌細胞系H1299 進行螢光素酶報告基因檢測，檢測結(jié)果（圖5）也驗證了這一點。過表達miR-193a-3p 抑制了ERBB4 和TP53INP1野生型3′UTR 螢光素酶活性（均為P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義，但是對ERBB4 和TP53INP1 的突變型3′UTR 螢光素酶活性卻沒有影響。該結(jié)果提示ERBB4 可能通過靶向調(diào)控miR-193a-3p 來調(diào)節(jié)TP53INP1 的表達，三者構(gòu)成競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 對肺腺癌細胞增殖的影響

我們進一步探究了ERBB4、miR-193a-3p 和TP53INP1 三者之間的作用聯(lián)系。如圖6 所示，沉默ERBB4 后細胞增殖速率顯著增加，但聯(lián)合miR-193a-3p 抑制劑或過表達TP53INP1 后細胞增殖速率降低，說明miR-193a-3p 抑制劑和過表達TP53INP1 能夠恢復由沉默ERBB4 造成的細胞增殖率增加，ERBB4 可通過miR-193a-3p/TP53INP1影響肺腺癌細胞增殖。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是導致癌癥相關(guān)死亡的主要原因[11]；而肺腺癌是最常見的肺癌類型，占原發(fā)性肺癌的30%～35%[12]。因此，探究肺腺癌的分子發(fā)生機制，對診斷和治療肺癌有著十分重要的意義。ERBB4 在不同人類腫瘤的生長和進展過程中發(fā)揮重要作用，但ERBB4 對腫瘤的作用還存在爭議。有研究表明ERBB4 發(fā)揮促癌作用[3-7]，但也有研究表明ERBB4 在腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用[8-10]。傳統(tǒng)上，ERBB4 作為細胞表面受體參與信號轉(zhuǎn)導，但有研究揭示了ERBB4 可以作為基因轉(zhuǎn)錄的輔助因子發(fā)揮作用，ERBB4 與配體結(jié)合后可分裂成多個片段并釋放胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域，然后胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會移位到細胞核，作為共轉(zhuǎn)錄因子，導致基因表達的激活[5,13]。如ERBB4 的下調(diào)會導致TP53INP1 的轉(zhuǎn)錄抑制[10]。我們知道，TP53INP1 是一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子，通過增強p53 功能，可以抑制腫瘤的發(fā)生[14]。所以，本研究的目的就是探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表達及其作用關(guān)系。

圖5 螢光素酶報告基因檢測ERBB4 和TP53INP1 均為miR-193a-3p 的靶基因

圖6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 軸對肺腺癌細胞增殖的影響

本研究結(jié)果顯示，ERBB4 與TP53INP1 在肺腺癌組織和細胞中均明顯低于正常對照，且兩者的表達呈正相關(guān)的關(guān)系，ERBB4 沉默或過表達使TP53INP1 的蛋白表達也相應(yīng)減少或增加。該結(jié)果預示著ERBB4 的表達與TP53INP1 的表達可能存在某種聯(lián)系。隨后我們通過靶基因預測軟件starBase 和螢光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)ERBB4 和TP53INP1 均是miR-193a-3p 的靶基因，均受miR-193a-3p 的調(diào)控表達。Liang 等[15]也發(fā)現(xiàn)ERBB4 受miR-193a-3p 靶向調(diào)控。本結(jié)果表明ERBB4 通過靶向調(diào)控miR-193a-3p 來調(diào)節(jié)TP53INP1 的表達，三者構(gòu)成ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p 抑制劑和過表達TP53INP1 能夠緩解由沉默ERBB4 提高的細胞增殖，ERBB4 可以通過miR-193a-3p-TP53INP1 影響肺腺癌進展。Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示肺腺癌組織中ERBB4 和TP53INP1 均高表達，與OS 良好顯著相關(guān)，ERBB4/TP53INP1 表達越高，肺腺癌的預后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表達均可以作為肺腺癌患者整體生存率的獨立預后指標。

綜上所述，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織或細胞中均低表達，2 個基因的表達呈正相關(guān)，ERBB4通過靶向調(diào)控miR-193a-3p 來調(diào)節(jié)TP53INP1 的表達，且ERBB4 和TP53INP1 表達越高，肺腺癌的預后效果就越好。ERBB4 或TP53INP1 表達可以作為肺腺癌患者預后指標。