張琪，周靜，周江林，孔娜，胡明達(dá)，彭小川，李北平，梁龍，靳遠(yuǎn)，任洪廣，岳俊杰

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

原核生物的可移動(dòng)遺傳元件（mobile genetic element，MGEs）可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式介導(dǎo)遺傳物質(zhì)在不同種屬細(xì)菌間的橫向（水平）基因轉(zhuǎn)移（lateral/horizontal gene transfer，LGT/HGT）。Burrus 于2002 年首次對(duì)那些可以從染色體上剪切并整合進(jìn)宿主染色體，通過(guò)接合的方式在細(xì)菌細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的遺傳元件進(jìn)行了歸類，稱之為整合性接合元件（integrating conjugative elements，ICEs）[1]。ICEs 兼有質(zhì)粒和噬菌體的特征，與接合性質(zhì)粒相似，它可通過(guò)接合的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移；與質(zhì)粒不同的是，它們不能自主復(fù)制，其復(fù)制方式與溫和噬菌體相似，通過(guò)整合進(jìn)宿主染色體，隨宿主染色體一起復(fù)制[2]。ICEs 具有吸收和傳播包括毒力因子及耐藥基因在內(nèi)的多種特性基因進(jìn)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的功能。它們常賦予宿主細(xì)菌新的性狀，如耐藥性和致病性等[3]。

迄今，已在多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了ICEs，但目前還沒(méi)有公認(rèn)的ICEs 分類方法。歐竑宇提出了根據(jù)整合酶序列相似性以及核心結(jié)構(gòu)同線性的特征對(duì)ICEs 進(jìn)行分類的方法[4]，按照這種方法可以把發(fā)現(xiàn)的大部分ICEs 歸為28 個(gè)家族。SXT/R391是目前已知的ICEs 中研究最早和最詳細(xì)的一個(gè)家族[5]。

SXT 元件最早發(fā)現(xiàn)于1992 年在印度和孟加拉導(dǎo)致霍亂的O139 群霍亂弧菌MO10 的染色體上，該元件能夠以整合接合的方式進(jìn)入宿主菌染色體。SXT 攜帶多種耐藥基因，能夠介導(dǎo)霍亂弧菌對(duì)磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，Su）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim，Tm）、鏈霉素（streptomycin，Sm）和氯霉素（chloramphenicol，Cm）的耐藥性。當(dāng)時(shí)根據(jù)其攜帶的基因編碼對(duì)磺胺甲惡唑和甲氧芐胺嘧啶的抗性而命名為SXT[6]。R391 在上世紀(jì)70年代早期被鑒定為賦予抗卡那霉素的質(zhì)粒，最初被認(rèn)為是不相容性群質(zhì)?！癐ncJ”的原生代表。20多年后，很多研究表明R391 和其他被稱作“R 因子”的遺傳元件具有與SXT 高度類似的基因組骨架結(jié)構(gòu)以及固定的染色體插入/重組位點(diǎn)，它們與SXT 實(shí)際上屬于同一類型的整合接合元件，因此將這一類元件劃分為同一個(gè)SXT/R391 家族。

目前發(fā)現(xiàn)的SXT/R391 元件基因組的大小為70～120 kb。SXT/R391 元件的基因組包括核心保守區(qū)和可變區(qū)兩部分[5,7-8]。SXT/R391 元件的保守區(qū)編碼的基因介導(dǎo)SXT 元件的整合/切除、接合轉(zhuǎn)移和ICEs 生命周期所需的調(diào)控，另外一些保守基因的功能未知。SXT/R391 可變區(qū)基因的編碼產(chǎn)物主要負(fù)責(zé)宿主對(duì)抗生素的耐藥性、重金屬離子抗性、生物膜形成和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)，另外也編碼毒素-抗毒素系統(tǒng)、限制性修飾系統(tǒng)、解旋酶、核酸內(nèi)切酶等[9]。

作為多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）基因的載體，SXT 元件在菌株間播散可造成新的優(yōu)勢(shì)菌型流行。SXT/R391 元件的進(jìn)化是造成其擴(kuò)散能力增強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)力。闡明SXT/R391 家族元件的進(jìn)化特征有助于防止SXT 元件擴(kuò)散，將對(duì)致病菌防控研究起到重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)搜集

首先以“SXT/R391”及“ICE”為關(guān)鍵詞在PubMed 中搜索獲得含有報(bào)道SXT/R391 元件的文獻(xiàn)，通過(guò)閱讀文獻(xiàn)獲取SXT/R391 元件的序列信息。接著進(jìn)行SXT/R391 元件的預(yù)測(cè)，為了保證獲得完整的SXT/R391 元件序列，我們從基因組序列完整度為完整基因組（Complete Genome）和染色體（Chromosome）狀態(tài)的9632 個(gè)細(xì)菌基因組序列中搜索SXT/R391 元件。通過(guò)BLASTp 軟件進(jìn)行比對(duì)，匹配結(jié)果中包含整合與剪切模塊（integration/excision module）、DNA 分泌模塊（DNA secretion module）和調(diào)控模塊（regulation module）等3 個(gè)必需模塊的蛋白區(qū)域推斷為潛在的ICE，如果在一段連續(xù)區(qū)域內(nèi)（70～130 kb）出現(xiàn)編碼SXT/R391 家族元件的整合酶Int、Ⅳ型分泌系統(tǒng)接合蛋白和調(diào)控蛋白SetR 的基因，則預(yù)測(cè)該基因組存在一個(gè)完整的SXT/R391 元件。最終，我們通過(guò)文獻(xiàn)和預(yù)測(cè)獲得83 個(gè)SXT/R391 家族元件。

1.2 研究方法

提取SXT/R391 元件的52 個(gè)核心基因序列，對(duì)83 個(gè)元件做Blast 分析，分析每個(gè)基因在83 個(gè)元件上的分布和復(fù)制情況。

1.2.1 重組分析 應(yīng)用分子生物學(xué)軟件包RDP4[10]中的RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera 等5 種較為常見(jiàn)的方法，分別探測(cè)83 個(gè)SXT/R391 元件的52 個(gè)核心基因序列的重組事件和重組信號(hào)。其中，GENECONV 的參數(shù)g-scale 設(shè)置為1，允許重組片段內(nèi)部的錯(cuò)配；其他方法的參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，不作修改。P≤0.01 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

1.2.2 正選擇分析 選擇在線工具Datamonkey（http://datamonkey.org/）[11]進(jìn)行SXT/R391 元件核心基因的正選擇壓力分析。首先使用MUSCLE 進(jìn)行序列比對(duì)，提交序列及選擇運(yùn)算模型。我們選擇了4 種模型，即隨機(jī)效應(yīng)似然法（REL）、固定效應(yīng)似然法（FEL）、單一祖先計(jì)數(shù)法（SLAC）及混合效應(yīng)進(jìn)化模型方法（MEME）。依據(jù)ω 值［ω=dN/dS（非同義置換率/同義置換率）］判斷選擇的方向。當(dāng)ω＞1 且差異顯著時(shí)判斷為正向選擇，0＜ω＜1 時(shí)為凈化選擇，ω=1 時(shí)為中性選擇。

2 結(jié)果

2.1 SXT/R391 元件的序列整理及菌屬分布

通過(guò)文獻(xiàn)收集和預(yù)測(cè)共獲得83 個(gè)SXT/R391元件的基因組序列，包括從文獻(xiàn)中提取的54 個(gè)和細(xì)菌基因組序列中預(yù)測(cè)的29 個(gè)，元件所在宿主基因組的分離時(shí)間為1967～2014 年，地理分布包括21 個(gè)國(guó)家和地區(qū)，元件宿主跨越25 個(gè)菌屬。在預(yù)測(cè)的29 個(gè)SXT/R391ICE 元件中，有12 個(gè)曾經(jīng)被報(bào)道，但未提取和報(bào)道元件的完整序列。SXT/R391元件的宿主廣泛（圖1），但分布存在較大偏性，在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多，奇異變形桿菌緊隨其后。有趣的是，臨床發(fā)現(xiàn)的SXT/R391 元件也都集中在霍亂弧菌和奇異變形桿菌。在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的SXT/R391 元件大多來(lái)自水環(huán)境。SXT/R391的菌種分布不均勻，說(shuō)明元件能在宿主中存在和保藏可能需要滿足一定的遺傳背景。

2.2 核心基因分析

Wozniak 等對(duì)13 個(gè)SXT/R391 元件的基因組進(jìn)行了比較分析[7]，發(fā)現(xiàn)該元件具有52 個(gè)核心基因。我們提取了SXT/R391 元件的52 個(gè)核心基因序列，對(duì)獲得全基因組信息的83 個(gè)SXT/R391 元件的全基因組序列進(jìn)行同源搜索，分析元件的核心基因的分布情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。

83 個(gè)SXT/R391 元件中有一個(gè)特殊的成員ICEPmiChn3，該元件缺少20 個(gè)核心基因，其中13個(gè)發(fā)揮接合功能。缺少的20 個(gè)核心基因被一個(gè)新的由轉(zhuǎn)座子和耐藥基因組成的基因簇取代。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該元件的接合功能完全喪失[12]，因而ICEPmiChn3 已經(jīng)不是一個(gè)具有完整組件和功能的元件。因此，后續(xù)的核心基因數(shù)量分析排除了該元件。

經(jīng)過(guò)計(jì)算，52 個(gè)核心基因中有39 個(gè)依然出現(xiàn)在全部元件中。另外有6 個(gè)基因僅在1 個(gè)元件中缺少，這些基因可稱為軟核心基因（soft core）[13]。另有7 個(gè)基因（rumA、s024、s025、s026、traL/E/K）在2 個(gè)或2 個(gè)以上元件中缺失，其中的rumA、s024、s025、s026都是SXT/R391 元件擴(kuò)散所需的最小功能基因集合，缺失這些基因可能會(huì)影響元件的傳播擴(kuò)散。以上結(jié)果說(shuō)明從文獻(xiàn)報(bào)道的13 個(gè)元件中推導(dǎo)出的52 個(gè)核心基因并不都是嚴(yán)格保守的核心基因，其中有一些基因?qū)儆谲浐诵幕颉?/p>

圖1 SXT/R391 的菌屬分布

值得注意的是，83 個(gè)元件的整合酶基因有2類，分別為int-1、int-2，2 類間的序列相似性僅為22%。裂解酶xis基因也有2 類，分別為xis-1、xis-2。我們發(fā)現(xiàn)在元件中，int-1與xis-1協(xié)同出現(xiàn)，int-2和xis-2協(xié)同出現(xiàn)。

另外，從圖2 可以看出，traFHG、eex、setC、setD、s082、s083、s084、s086、setR基因在菌株Alteromonas macleodiistr.MED6-ICE 的SXT/R391 元件中出現(xiàn)了整體的基因復(fù)制。

2.3 核心基因的融合和裂解

除了基因復(fù)制，還有少數(shù)核心基因呈現(xiàn)了基因融合/裂解信號(hào)。全長(zhǎng)rumB基因讀框長(zhǎng)度為1269 bp，蛋白產(chǎn)物為423 aa，但該基因在46 個(gè)元件表現(xiàn)為2 個(gè)及更多的片段（圖3），說(shuō)明rumB基因發(fā)生了基因融合/裂解，可能與位點(diǎn)附近發(fā)生的頻繁的插入有關(guān)。

此外，trhF與traW在一些元件中為2 個(gè)基因。如在元件Proteus mirabilisMD20140901（KX243408）中，trhF讀框［54557..55069］，長(zhǎng)度513 bp，蛋白產(chǎn)物171 aa；traW讀框［55080..56204］，長(zhǎng)度1125 bp，蛋白產(chǎn)物375 aa。再如，在元件Vibrio choleraeO37MZ03（JQ345361）中，trhF讀框［26846..27358］，長(zhǎng)度513 bp，蛋白產(chǎn)物171 aa；traW讀框［27369..28493］，長(zhǎng)度1125 bp，蛋白產(chǎn)物375 aa。但在元件Providencia stuartiiATCC33672（CP008920）中，對(duì)應(yīng)的2 個(gè)基因融合為1 個(gè)基因，融合基因讀框［1904626..1906272］（基因組位置），長(zhǎng)度1647 bp，融合蛋白產(chǎn)物（549 aa）為type-F conjugative transfer system pilin assembly family protein（AIN64681.1）。

圖2 核心基因分布情況

圖3 rumB 基因在不同元件中的分布

2.4 核心基因的重組分析

元件之間的重組能導(dǎo)致形成新的雜合元件，重組事件是SXT/R391 元件多樣性產(chǎn)生的動(dòng)力之一。有研究報(bào)道，SXT/R391 元件核心區(qū)存在基因間重組。重組除了發(fā)生在基因及基因以上水平，還可能發(fā)生在亞基因水平（sub-gene level）。為了探測(cè)SXT/R391 元件的亞基因水平重組事件，我們檢測(cè)了SXT/R391 元件52 個(gè)核心基因的基因內(nèi)重組。在52 個(gè)核心基因中，有22 個(gè)核心基因在3種及3 種以上的方法中可以檢測(cè)到明顯的重組信號(hào)（表1）。

圖4 用紅色標(biāo)出了重組基因在SXT/R391 元件基因組上的位置，這些基因涉及元件核心基因的全部4 個(gè)必需功能模塊，即整合與剪切模塊、DNA 復(fù)制及加工模塊（replication/DNA processing module）、DNA 分泌模塊和調(diào)控模塊。分泌模塊，即Ⅳ型分泌系統(tǒng)（type Ⅳsecretion system，T4SS）有關(guān)基因簇的大部分基因都檢測(cè)到了重組信號(hào)。此外，還有一些具有重組信號(hào)的核心基因?yàn)槲粗δ芑颉?/p>

2.5 正選擇分析

正選擇（positive selection）也是微生物進(jìn)化過(guò)程中獨(dú)立的遺傳變異驅(qū)動(dòng)力，在生物的適應(yīng)性進(jìn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們檢測(cè)了SXT/R391 元件基因組中基因的正選擇信號(hào)。為了避免重組事件對(duì)正選擇分析造成干擾，我們只在未發(fā)生重組事件的核心基因上檢測(cè)正選擇。計(jì)算結(jié)果顯示，除去以上分析的22 個(gè)發(fā)生重組的核心基因，SXT/R391 元件中沒(méi)有重組信號(hào)的30 個(gè)核心基因中有7 個(gè)檢測(cè)到正選擇信號(hào)（表2）。這7 個(gè)基因中的mobI和traJ編碼SXT/R391 元件接合轉(zhuǎn)移所需蛋白，其他5 個(gè)基因編碼未知功能蛋白，且不在SXT/R391 ICE 最小功能基因集合（minimal functional SXT/R391 ICE gene set）中，它們對(duì)SXT/R391 元件多樣性的貢獻(xiàn)有待進(jìn)一步研究。

表1 核心基因重組信號(hào)檢測(cè)

圖4 22 個(gè)發(fā)生重組的核心基因在SXT/R391 元件骨架上的位置

表2 核心基因的正選擇氨基酸數(shù)量與位點(diǎn)

利用I-TASSER 軟件對(duì)mobI和TraJ基因編碼的蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[14]。從預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)圖（圖5）中可以看出，mobI基因編碼的蛋白上正選擇位點(diǎn)52、104 殘基處于α螺旋結(jié)構(gòu)的端頭，130殘基位于另一α螺旋結(jié)構(gòu)上；TraJ 基因編碼的蛋白發(fā)生正選擇的位點(diǎn)62 殘基正處于α螺旋結(jié)構(gòu)的端頭位置，195 殘基位于α螺旋結(jié)構(gòu)上，根據(jù)預(yù)測(cè)該蛋白的191～210 殘基為一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，正選擇位點(diǎn)195 殘基處于該結(jié)構(gòu)域內(nèi)。以上位點(diǎn)所處的蛋白結(jié)構(gòu)域或與轉(zhuǎn)移運(yùn)輸有關(guān)，這些位點(diǎn)受到選擇壓力可能與元件的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相關(guān)。

圖5 mobI 基因（A）和traJ 基因（B）編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)及正選擇位點(diǎn)

3 討論

作為MDR基因的載體，SXT 元件在菌株間播散可造成新的優(yōu)勢(shì)菌型流行。SXT/R391 元件的進(jìn)化是造成其擴(kuò)散能力增強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)力。闡明SXT/R391 家族ICEs 的進(jìn)化特征、遷移模式及其散播的分子機(jī)制，有助于防止SXT 元件擴(kuò)散，對(duì)致病菌防控研究有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。SXT/R391 元件的核心基因決定了元件的復(fù)制和轉(zhuǎn)移。重組和正選擇是微生物進(jìn)化過(guò)程中2 種獨(dú)立的遺傳變異驅(qū)動(dòng)力，在生物的適應(yīng)性進(jìn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究收集了目前發(fā)現(xiàn)的SXT/R391元件，對(duì)核心基因的分布以及核心基因的重組和正選擇兩大進(jìn)化特征進(jìn)行了分析。

本研究表明，同源重組和正選擇在SXT/R391元件核心基因的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。我們發(fā)現(xiàn)了22 個(gè)核心基因在進(jìn)化中經(jīng)歷了同源重組，導(dǎo)致了元件相當(dāng)一部分核心基因的遺傳變異。另外，有7 個(gè)核心基因存在正選擇信號(hào)，其中2 個(gè)基因mobI和traJ與元件的接合轉(zhuǎn)移有關(guān)。元件發(fā)生重組和正選擇變異都是為了SXT/R391 元件適合度的提升，從而能適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的變化。綜上，我們分析了SXT/R391 元件核心基因的特征及適應(yīng)性進(jìn)化，為了解SXT/R391 元件的擴(kuò)散及進(jìn)化規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。