馮麗雄,彭 鶯,萬恒興

(深圳技師學(xué)院 應(yīng)用生物系，廣東 深圳 518116)

2008版歐盟 GMP附件8《原輔包裝材料的取樣》法規(guī)對起始物料規(guī)定，起始物料取樣需要對每個包裝進行單獨取樣，獨立檢測鑒別[1]。中國2010版GMP也要求對每一包裝內(nèi)的原輔料進行確認。確認方式包括逐一鑒別或核對確認，用于注射劑的原輔料需要逐一鑒別[2]。國內(nèi)頭孢菌素內(nèi)的原料廠家(華北制藥河北華民藥業(yè)，齊魯安替制藥有限公司，浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，浙江普洛得邦制藥有限公司，深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，國藥集團致君(蘇州)制藥有限公司，珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，蘇州東瑞制藥有限公司，麗珠集團麗珠制藥廠，廣東立國制藥有限公司)均裝在鋁桶內(nèi)，見圖1。鑒別需要對原料進行取樣，二次開桶對原料，特別是無菌原料，存在微生物污染的風(fēng)險。對于非無菌原料，企業(yè)通過逐件的核對標簽信息，按照企業(yè)的制定取樣規(guī)則進行抽樣檢驗，通過供應(yīng)商審核等措施，來避免物料的混淆，但還是無法符合歐盟審計要求[3]。

圖1 頭孢菌素原料鋁桶

2015年版中國藥典通則收錄拉曼光譜法為藥典方法[4]，拉曼光譜具有檢測時間短、 樣品量小，樣品無需處理、非接觸性、非破壞性等優(yōu)點，可用于定性和定量檢測[5-6]。拉曼光譜在國內(nèi)外逐漸被廣泛使用[7-8]。手持式快速拉曼分析儀具有體積小、質(zhì)量輕、易于攜帶，適用于企業(yè)車間快速檢測[9]。

本文用對照品建立部分頭孢菌素原料拉曼光譜圖庫，通過命中率指數(shù)(hit quality index，HQI)對標準圖庫進行評價，并對鑒別的準確性進行驗證，方法運用于生產(chǎn)快速的鑒別，避免頭孢菌素類原料二次開桶微生物污染風(fēng)險。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

瑞士萬通Mira M-1手持式快速拉曼分析儀，激光器(激發(fā)波長):785 nm；波長范圍: 400 ～ 2300 cm-1；光譜分辨率 12 ～ 14 cm-1(半峰寬) ；檢測方式：逐格掃描(orbital raster scan ，ORS)；曝光時間：自動模式；分析軟件：snowy range peak。

1.2 藥品

頭孢唑啉鈉(來源：華北制藥河北華民藥業(yè)；齊魯安替制藥有限公司)，頭孢地尼(來源：浙江永寧藥業(yè)股份有限公司；浙江普洛得邦制藥有限公司)，頭孢克肟(來源：浙江普洛得邦制藥有限公司；齊魯安替制藥有限公司)，頭孢西丁鈉(來源：深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司；國藥集團致君(蘇州)制藥有限公司；華北制藥河北華民藥業(yè))，頭孢噻肟鈉(來源：華北制藥河北華民藥業(yè)；珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司；蘇州東瑞制藥有限公司)，頭孢曲松鈉(來源：麗珠集團麗珠制藥廠；齊魯安替制藥有限公司)，頭孢呋辛酯(來源：廣東立國制藥有限公司；珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司)，頭孢呋辛鈉(來源：國藥集團致君(蘇州)制藥有限公司；廣東立國制藥有限公司；深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司)；對照品來源(國藥致君(深圳)制藥有限公司中心化驗室)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照拉曼光譜圖庫建立

拉曼光譜圖庫中每個光譜代表一種原料。本文用選定研究對象的對照品來建立拉曼光譜圖庫。對照品裝在硼硅玻璃管制注射劑瓶中，選用短聚焦鏡頭(焦點聚鏡頭0.85 mm)掃描注射劑瓶底部位置，每個對照掃描6次，同個品種掃描的拉曼光譜通過軟件進行平均，作為對照拉曼光譜圖庫，見圖2所示。拉曼光譜相似性常用相似性函數(shù)、距離測度和峰匹配進行評價[10]。本文采用命中率指數(shù)相似性函數(shù)對光譜圖庫中兩個光譜進行初步評估。HQI在0和1之間，HQI越接近1，兩個光譜的相似程度越高。計算圖譜庫中任意兩個圖譜的HQI，設(shè)置HQI閾值為0.95，若HQI高于0.95，兩個拉曼光譜相似度高[11]。圖譜庫中若有兩個或兩個以上的圖譜的HQI高于0.95，產(chǎn)品存在錯誤鑒別的風(fēng)險，須進行可行性評估。對照圖庫HQI矩陣結(jié)果見表1。HQI矩陣結(jié)果顯示，不同品種的之間的HQI均小于0.90。頭孢呋辛酯是頭孢呋辛的衍生物[12]，結(jié)構(gòu)相似，相互的HQI為0.84和0.86。

表1 標準圖譜庫命中率指數(shù)

A頭孢唑啉鈉； B頭孢地尼；C頭孢克肟；D頭孢西丁鈉；E頭孢噻肟鈉；F頭孢曲松鈉；G頭孢呋辛酯；H頭孢呋辛鈉

圖 2 對照品拉曼圖譜

Fig.2 References Raman spectra

2.2 拉曼光譜圖庫驗證

采用概率測試(F-檢測)，用主成分分析對建立的圖庫進行驗證。 在驗證圖庫中采用測試臨界數(shù)p值評估，判斷測試樣品是否與拉曼光譜圖庫中的對照圖譜一致。對于鑒定“通過”，p值必須高于(1-閾值)，對于 鑒定“失敗”，p值低于(1- 閾值)。在本實驗的驗證過程中，選擇閾值0.95。隨機抽取樣品來評估評估圖庫專屬性，所有待鑒定的樣本按照圖庫建立的操作程序進行測試。拉曼光譜圖庫驗證滿足兩個條件：1)如果使用正確的樣品來測試光譜圖庫，則“通過”(真陽性)；2)如果使用不正確的樣品來測試光譜圖庫，則“失敗”(真陰性)，見圖3。驗證不同的供應(yīng)商的原料各選擇20批樣品進行測試。420批樣品驗證HQI矩陣結(jié)果見表2。陽性樣品HQI均大于0.98，陰性樣品的HQI均小于0.90。420批樣品驗證鑒定正確率100%。

圖3 拉曼圖庫驗證條件

表2 驗證測試矩陣結(jié)果

Table 2 Matrix for validation results

注:P表示鑒定“通過”；F表示鑒定“失敗”

3 討論

在建立拉曼光譜標準圖庫時，為了提高鑒別的正確率，裝對照品容器的材質(zhì)需和車間取樣鑒別的材質(zhì)一致，用不同材質(zhì)的兩種容器(透明的塑料取樣袋和低硼硅玻璃管制注射劑瓶)進行測試,HQI值降低0.01。

在樣品驗證矩陣結(jié)果中，對角線(表2 綠色部分)的HQI值應(yīng)為1.00(或非常接近1.00，若HQI在0.97～0.99之間，在實驗誤差范圍內(nèi)是可以接受的)。非對角線樣品HQI大于 0.85，鑒別有潛在混淆的風(fēng)險；HQI在0.85和0.95之間表示混淆的風(fēng)險是輕微的；若HQI大于0.95，存在重大混淆的風(fēng)險，需進一步評估鑒別的可行性。企業(yè)可以根據(jù)驗證的數(shù)據(jù)，通過風(fēng)險評估確定合適的命中率指數(shù)作為鑒別合格放行標準。

建立的鑒別方法應(yīng)結(jié)合企業(yè)實際的取樣規(guī)程，確保車間取樣操作流程符合企業(yè)文件要求，避免審計缺陷。

4 結(jié)論

本試驗建立了手持式拉曼快速鑒別部分頭孢菌素類原料方法，用命中率指數(shù)對拉曼光譜圖庫進行評估和驗證，結(jié)果表明該方法簡便、準確，可以用于頭孢菌素類企業(yè)生產(chǎn)的快速鑒別。