陳武奇，謝佳佳，楊瑤琳

(廣東省第二人民醫(yī)院，廣州 510317)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD)是因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)冠狀動(dòng)脈狹窄、硬化、堵塞，從而導(dǎo)致心肌供血不足或壞死的一種心臟疾病。CAD是最為常見的心血管疾病之一，日趨成為引發(fā)全球人民死亡的主要原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是CAD的發(fā)病基礎(chǔ)，且動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成后造成的冠狀動(dòng)脈急性狹窄和閉塞是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的重要原因[2]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在著多種多樣的免疫細(xì)胞，其中單核/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞是最主要的免疫成分，當(dāng)單核細(xì)胞和T細(xì)胞向血管內(nèi)膜遷移時(shí)便觸發(fā)了動(dòng)脈粥樣硬化的過程[3]。近年發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫調(diào)節(jié)分子——T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控分子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。且Tim-3對(duì)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞都有調(diào)節(jié)作用[5]，而這些免疫細(xì)胞都參與到動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中，提示我們Tim-3可能參與到動(dòng)脈粥樣硬化的免疫調(diào)節(jié)。因此本研究觀察了CAD患者外周血T細(xì)胞免疫球蛋白、Tim-3和炎癥因子的表達(dá)情況，探討Tim-3在CAD中與炎癥因子及病情的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年3月～2018年11月收入我院的CAD患者88例。所有患者因主訴胸痛而入院，進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影、心電圖、體格等檢查后，依據(jù)美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)和美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)(ACC/AHA)指南[6]，冠狀動(dòng)脈造影確診為冠狀動(dòng)脈病變(冠狀動(dòng)脈中至少有一支血管病變直徑狹窄程度≥50%)的患者為CAD患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：自身有免疫系統(tǒng)疾病者；糖尿病、肝腎功能不全者；合并感染性疾病、腦血管疾病或惡性腫瘤者；近年來接受過免疫抑制治療者。88例CAD患者根據(jù)病情分為ACS 46例(ACS組)、穩(wěn)定型心絞痛(SAP)42例(SAP組)。ACS組男22例、女24例，年齡(58.92±5.36)歲，BMI(22.48±3.06)kg/m2；SAP組患者男21例、女21例，年齡(58.02±5.09)歲，BMI(22.63±3.12)kg/m2。同時(shí)選取同期因胸痛入院，但冠狀動(dòng)脈造影確診為正常的受試者40例為對(duì)照組。對(duì)照組男21例、女19例，年齡(57.98±5.26)歲，BMI(21.93±3.02)kg/m2。所有患者自愿簽署知情同意書，且試驗(yàn)得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。三組患者的基線資料間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法 所有患者于清晨空腹時(shí)采集靜脈血3 mL，采用梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。采集靜脈血5 mL，制備血清以備免疫球蛋白、炎癥相關(guān)因子的檢測(cè)。

1.2.1 外周血不同T細(xì)胞亞群上Tim-3的表達(dá) 將100 μL PBMC置于流式管中，其中一份加入熒光標(biāo)記的抗人CD4和Tim-3單克隆抗體來檢測(cè)Tim-3在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)。另外一份加入熒光標(biāo)記的抗人CD8和Tim-3單克隆抗體用來檢測(cè)Tim-3在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)。當(dāng)抗體標(biāo)記完畢后，在4 ℃避光條件下孵育30 min，PBS洗滌2次后，4 ℃避光條件下1 500 r/min離心5 min，棄去上清后加入500 μL PBS重懸后利用流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-Coulter)進(jìn)行檢測(cè)。熒光標(biāo)記的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)美國(guó)Beckman-Coulter公司。

1.2.2 外周血免疫球蛋白檢測(cè) 利用免疫散射比濁法(美國(guó)BECKMAN ARRAY 360 SYSTEM)檢測(cè)患者外周血中的IgA、IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4。

1.2.3 血清炎癥相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)三組血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。ELISA試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司，按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血T細(xì)胞上Tim-3表達(dá)比較 ACS組、SAP組外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)率均高于對(duì)照組(P均<0.05)，且ACS組均高于SAP組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與SAP組相比，#P<0.05。

2.2 三組外周血免疫球蛋白、補(bǔ)體水平比較 ACS組、SAP組外周血IgG、補(bǔ)體C3和C4水平高于對(duì)照組(P均<0.05)，且ACS組高于SAP組(P均<0.05)，三組IgA和IgM水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 三組血清免疫球蛋白、補(bǔ)體水平比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與SAP組相比，#P<0.05。

2.3 三組血清炎癥相關(guān)因子水平比較 ACS組、SAP組血清TNF-α、hs-CRP水平高于對(duì)照組(P均<0.05)，且ACS組高于SAP組(P均<0.05)。

表3 三組血清炎癥相關(guān)因子水平比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與SAP組相比，#P<0.05。

2.4 炎癥相關(guān)因子、T細(xì)胞免疫球蛋白與Tim-3表達(dá)率的相關(guān)性 ACS組CD4+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)率與TNF-α、hs-CRP、IgG、C3和C4呈正相關(guān)(r分別為0.610、0.631、0.522、0.457、0.436，P均<0.05)；CD8+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)率與TNF-α、hs-CRP、IgG、C3和C4亦呈正相關(guān)(r分別為0.623、0.537、0.469、0.451、0.416，P均<0.05)。SAP組CD4+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)率與TNF-α、hs-CRP、IgG、C3和C4呈正相關(guān)(r分別為0.579、0.533、0.539、0.422、0.412,P均<0.05)；CD8+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)率與TNF-α、hs-CRP、IgG、C3和C4亦呈正相關(guān)(r分別為0.553、0.447、0.411、0.402、0.396，P均<0.05)。

3 討論

CAD是一個(gè)多種因素參與的緩慢發(fā)展的疾病，其發(fā)病基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化。而動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定性斑塊的破裂、血小板聚集導(dǎo)致血栓的形成造成的冠狀動(dòng)脈急性狹窄是導(dǎo)致ACS的重要原因。其中免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的形成、在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。外周T細(xì)胞亞群分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞又稱為輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th)，分為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等多個(gè)亞型。CD4+T細(xì)胞的功能為合成并產(chǎn)生細(xì)胞因子，協(xié)助B細(xì)胞分泌抗體、調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，達(dá)到維持免疫平衡的作用。CD8+T細(xì)胞為抑制性/細(xì)胞毒T細(xì)胞，主要發(fā)揮抑制體液和細(xì)胞免疫的功能，表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性[7]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的T細(xì)胞亞群主要以CD4+T細(xì)胞為主，T細(xì)胞特異識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化抗原后，氧化低密度脂蛋白和熱休克蛋白，導(dǎo)致IL-2、TNF-α、hs-CRP等促炎因子的分泌，促進(jìn)免疫細(xì)胞在血管中的粘附，加重血管炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展[8,9]。有研究發(fā)現(xiàn)，Th分化失衡是誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的重要因素之一。人體研究已證實(shí)，Th分化失衡會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展、誘導(dǎo)斑塊的不穩(wěn)定性從而導(dǎo)致斑塊的破裂[10,11]。故而炎癥免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制逐漸成為研究的熱點(diǎn)，同時(shí)炎癥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究也有可能成為動(dòng)脈粥樣硬化治療的新途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，ACS組、SAP組中IgG、補(bǔ)體C3和C4的水平均較對(duì)照組高，且ACS組較SAP組升高的更為顯著。另一方面，ACS組血清炎癥因子TNF-α、hs-CRP水平高于SAP組、對(duì)照組，且SAP組高于對(duì)照組。其中可能的原因?yàn)椋篒gG的增高會(huì)拮抗已經(jīng)暴露的平滑肌細(xì)胞支架成分，會(huì)加重血管的損傷。同時(shí)補(bǔ)體激活后會(huì)產(chǎn)生大量的驅(qū)化因子，會(huì)加劇缺血組織的損傷。此外，補(bǔ)體及其產(chǎn)物也可通過非中性粒細(xì)胞依賴的機(jī)制來?yè)p害缺血心肌功能，加速免疫復(fù)合物的沉積，與炎癥因子TNF-α和hs-CRP共同加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程[12]。說明TNF-α、hs-CRP、IgG和補(bǔ)體與CAD病變的過程以及冠狀動(dòng)脈狹窄的程度具有一定的聯(lián)系。故而ACS患者外周血T細(xì)胞免疫球蛋白及炎癥因子表達(dá)最多。

Tim-3是一種新型免疫調(diào)節(jié)分子，其選擇性表達(dá)在分化中末期的Th細(xì)胞上，介導(dǎo)免疫耐受反應(yīng)。因此Tim-3表達(dá)的抑制已成為部分實(shí)體瘤的免疫治療方法之一[13,14]。Tim-3除了在T細(xì)胞上表達(dá)外，也在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞上表達(dá)，參與天然免疫調(diào)節(jié)。Tim-3與其配體半乳糖結(jié)合蛋白-9結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡，起到負(fù)調(diào)控作用，抑制T細(xì)胞的功能，促進(jìn)炎癥發(fā)展[15,16]。本研究結(jié)果顯示，ACS組、SAP組外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)率顯著高于對(duì)照組。Tim-3的高表達(dá)可能說明了T細(xì)胞功能的紊亂和耗竭，同時(shí)ACS組Tim-3表達(dá)顯著高于SAP組，可能也提示著Tim-3的表達(dá)率與CAD的病情嚴(yán)重程度、冠狀動(dòng)脈狹窄程度有密切的關(guān)系。即在CAD早期，Tim-3與受體結(jié)合后通過抑制T細(xì)胞的活性，造成機(jī)體免疫功能失衡，而隨著病情的加重，免疫失衡作用更為嚴(yán)重。這也為Tim-3在檢測(cè)CAD疾病進(jìn)展中作為關(guān)鍵的標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)提供了新的思路，但是Tim-3在不同病情的CAD(ACS和SAP)中調(diào)控CD4+T、CD8+T細(xì)胞的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：CD4+T、CD8+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)率均與TNF-α、hs-CRP、IgG、C3和C4呈正相關(guān)，顯示TNF-α、hs-CRP、IgG和補(bǔ)體與CAD病變的過程以及冠狀動(dòng)脈狹窄的程度具有一定的相關(guān)性。Tim-3對(duì)CD4+T、CD8+T細(xì)胞在CAD病情發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用。即Tim-3通過NF-κB調(diào)控TNF-α增加后，表達(dá)增多的hs-CRP與脂蛋白結(jié)合后激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生大量終末蛋白，在與TNF-α的共同作用下導(dǎo)致血管損傷、促使動(dòng)脈粥樣硬化形成，使斑塊不穩(wěn)定性增加[17,18]。

綜上所述，Tim-3在CAD患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞高表達(dá)，且Tim-3與CAD患者的病情和冠狀動(dòng)脈狹窄程度有一定的關(guān)系，有望成為監(jiān)測(cè)CAD病情變化的新指標(biāo)。