郭軍利，沈東波，李學(xué)剛，張慧濤

(1 珠海市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院，廣東珠海 519000；2 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院)

狼瘡性腎炎(LN)屬于系統(tǒng)性紅斑狼瘡最為常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，發(fā)病率為60%～80%，可能引起不同程度的腎損傷，病情嚴(yán)重時(shí)甚至可能引起死亡。該病的治療重點(diǎn)在于早期準(zhǔn)確的診斷以及治療，從而避免腎衰竭的發(fā)生[1]。當(dāng)前臨床上主要是通過(guò)24 h尿蛋白定量、腎小球?yàn)V過(guò)率、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度評(píng)分(SLEDAI)以及補(bǔ)體C3、C4水平等指標(biāo)協(xié)助LN的診斷以及評(píng)估其活動(dòng)性。IL-6、IL-18是重要的免疫因子，參與免疫調(diào)節(jié)及調(diào)控炎癥介質(zhì)。炎癥介質(zhì)在LN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程可加劇炎癥反應(yīng)以及增加腎臟功能損傷[2]。miRNA作為非編碼RNA之一，可通過(guò)和靶mRNA的3′-UTR以及5′-UTR區(qū)堿基互補(bǔ)配對(duì)，促使其發(fā)生降解或抑制其翻譯，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，參與多種生理以及病理過(guò)程，被認(rèn)為是最為理想的生物標(biāo)志物，可能成為L(zhǎng)N的有效診斷指標(biāo)[3]。目前，臨床上已有研究報(bào)道表明，miR-4532、miR-2861在糖尿病腎病患者的尿液中表達(dá)降低，且和腎小球?yàn)V過(guò)率以及腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[4]。然而，關(guān)于上述兩項(xiàng)指標(biāo)在LN患者血清中表達(dá)的相關(guān)研究并不多見(jiàn)。因此，本研究觀察了LN患者血清miR-4532、miR-2861表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2018年12月珠海市人民醫(yī)院和中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院接受診治的LN患者80例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟所制定的LN相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且均接受臨床檢查、影像學(xué)檢查以及實(shí)驗(yàn)室檢查等確診為L(zhǎng)N；年齡≥18周歲；入院前未接受降尿酸藥物、保腎藥物以及利尿劑等藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前7 d內(nèi)進(jìn)食高脂高蛋白食物以及大量飲酒等；合并高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病者；心、肝、肺等重要臟器發(fā)生病變者；交流溝通障礙或伴有精神疾病者。將其根據(jù)SLEDAI評(píng)分分為活動(dòng)期組(SLEDAI評(píng)分≥10分)42例與穩(wěn)定期組(SLEDAI評(píng)分<10分)38例。其中活動(dòng)期組男4例、女性38例，年齡22～58(32.32±5.33)歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18.33～30.31(24.61±4.66)kg/m2。穩(wěn)定期組男3例、女35例，年齡22～59(31.36±5.25)歲，BMI 18.29～30.35(24.57±4.62)kg/m2。另取同期珠海市人民醫(yī)院接受體檢的健康人員40例作為對(duì)照組，其中男5、女35例，年齡21～58(32.39±5.29)歲，BMI 18.24～30.37(24.66±4.65)kg/m2。三組基本資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)珠海市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有研究者知情同意。

1.2 血清miR-4532、miR-2861檢測(cè) 采集所有受試者清晨空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，將獲取的血清保存于-80 ℃冰箱中備用。采用RNA提取純化試劑盒(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA，隨后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)各組血清miR-4532、miR-2861。以U6為內(nèi)參對(duì)照，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 2 min進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min完成35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃、5 min完成1個(gè)循環(huán)。miR-4532上游引物序列為5′-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3′,下游引物序列為5′-GCACCATCCAAACCACTG-3′。miR-2861上游引物序列為5′-GTCATAGTGCTGGATGGT-3′，下游引物序列為5′-CGGTGGAAGAATACTTATTG-3′。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-4532、miR-2861相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清IL-6、IL-18水平，試劑盒購(gòu)自上海吉泰依科賽生物科技有限公司。采用貝克曼IMMAGE800特定蛋白分析儀測(cè)定C3、C4及24 h尿蛋白定量。采用腎動(dòng)態(tài)顯像法測(cè)定腎小球?yàn)V過(guò)率。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-4532、miR-2861表達(dá)比較 活動(dòng)期組、穩(wěn)定期組血清miR-4532、miR-2861表達(dá)均較對(duì)照組低(P均<0.05)，且活動(dòng)期組較穩(wěn)定期組低(P均<0.05)，見(jiàn)表1?；顒?dòng)期組、穩(wěn)定期組腎小球?yàn)V過(guò)率、補(bǔ)體C3、C4水平均較對(duì)照組低(P均<0.05)，且活動(dòng)期組較穩(wěn)定期組低(P均<0.05)，見(jiàn)表1。活動(dòng)期組、穩(wěn)定期組血清IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量水平較對(duì)照組高(P均<0.05)，且活動(dòng)期組較穩(wěn)定期組高(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血清miR-4532、miR-2861表達(dá)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與穩(wěn)定期組相比，*P<0.05。

2.2 LN患者血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性 LN活動(dòng)期組患者血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與血清IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量以及SLEDAI評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，而與腎小球?yàn)V過(guò)率呈正相關(guān)(P均<0.05)，見(jiàn)表2；而穩(wěn)定期組患者血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。

表2 LN活動(dòng)期組患者血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 血清miR-4532、miR-2861診斷LN的價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析可得：血清miR-4532診斷LN的ROC曲線下面積為0.732(95%CI：0.651～0.834)，最佳閾值為7.58，敏感度為81.14%，特異度為64.23%；而miR-2861診斷LN的ROC曲線下面積為0.741(95%CI：0.623～0.802)，最佳閾值為8.90，敏感度為78.35%，特異度為66.82%。

3 討論

LN是指系統(tǒng)性紅斑狼瘡并發(fā)雙腎功能顯著受損的一種免疫性疾病，患者主要臨床表現(xiàn)囊括蛋白尿、腎功能下降以及血尿等，其發(fā)病可能和免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子以及免疫復(fù)合物形成等多種免疫異常密切相關(guān)[5]。已有研究[6]表明，Th1/Th2細(xì)胞因子平衡失調(diào)在體內(nèi)許多自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡中發(fā)揮重要且關(guān)鍵的作用。IL-18和IL-6作為T(mén)h1和Th2重要的細(xì)胞因子，在診斷LN以及評(píng)估疾病的活動(dòng)性方面發(fā)揮著重要的作用[7]。相比正常人以及穩(wěn)定期患者，活動(dòng)期LN患者IL-18和IL-6明顯升高。然而，機(jī)體自身炎癥以及免疫狀態(tài)容易影響IL-18和IL-6的水平，蛋白尿和補(bǔ)體C3、C4的水平也容易受到其他因素的影響[8]。因此上述實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)診斷LN的特異性較差，臨床應(yīng)用存在一定的局限性。

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)21～25 nt的單鏈小分子RNA，來(lái)源于染色體的非編碼區(qū)，具有高度保守性，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，主要參與調(diào)控人體30%左右的基因表達(dá)，作用涉及到生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。腎臟中也會(huì)特異地缺失或者低表達(dá)某些特異miRNA，能夠通過(guò)調(diào)控靶基因，產(chǎn)生調(diào)節(jié)腎臟功能的特異性蛋白，介導(dǎo)腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。且近年來(lái)研究[10,11]證實(shí)，miRNA可能通過(guò)調(diào)控機(jī)體的淋巴細(xì)胞功能以及免疫細(xì)胞反應(yīng)活性，繼而參與LN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。而miR-4532、miR-2861是近年新發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控機(jī)體淋巴細(xì)胞功能以及免疫細(xì)胞反應(yīng)活性的miRNA。目前，臨床上有學(xué)者認(rèn)為遺傳、性激素、環(huán)境、病毒感染以及藥物等多因素共同作用是LN的發(fā)病機(jī)制[12]。而隨著相關(guān)研究的不斷深入，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)LN的發(fā)病可能和淋巴細(xì)胞功能異常以及細(xì)胞因子的異常表達(dá)密切相關(guān)，且炎癥可能在LN的發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[13]。miR-4532、miR-2861能否通過(guò)調(diào)控炎癥因子的表達(dá)活性影響疾病的活動(dòng)性，值得臨床深入探討和研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LN活動(dòng)期組血清miR-4532、miR-2861較對(duì)照組和LN穩(wěn)定期組低，且活動(dòng)期組IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量水平較高，腎小球?yàn)V過(guò)率及補(bǔ)體C3、C4水平較低，提示血清miR-4532、miR-2861表達(dá)可能與LN患者的活動(dòng)性有關(guān)，且活動(dòng)期LN患者臨床腎功能低下，反映活動(dòng)性的指標(biāo)升高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，LN活動(dòng)期組血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與血清IL-6、IL-18水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示LN活動(dòng)期患者的血清miR-4532、miR-2861表達(dá)下調(diào)可能對(duì)其腎損傷程度以及機(jī)體炎癥水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。分析原因，IL-6主要是由T淋巴細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞分泌而來(lái)的細(xì)胞因子，參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其表達(dá)異常增高極易引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的紊亂，從而在LN的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。IL-18屬于促炎癥細(xì)胞因子之一，可通過(guò)和內(nèi)皮細(xì)胞表面的蛋白多糖相結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮及內(nèi)皮下基質(zhì)相結(jié)合，從而促進(jìn)白細(xì)胞的滲出游走，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的發(fā)生，繼而增加LN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[14]。杲和艷等[13]研究同樣表明，miR-4532、miR-2861表達(dá)與LN的活動(dòng)性和炎癥水平相關(guān)。由此可見(jiàn)，miR-4532、miR-2861表達(dá)升高可以通過(guò)調(diào)控降低IL-6和IL-18水平，在減輕腎臟炎癥和損傷方面起到重要的保護(hù)作用。

腎小球?yàn)V過(guò)率主要是指腎臟于單位時(shí)間內(nèi)所生成的超濾液量，在腎功能評(píng)估中價(jià)值較高[15]。有研究[16,17]發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血清miR-4532、miR-2861表達(dá)降低與腎小球?yàn)V過(guò)率、腎間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮存在一定相關(guān)性。另有研究學(xué)者[18]提出，LN患者miRNA表達(dá)的異?？赡芘c毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥具有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，LN活動(dòng)期組血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與腎小球?yàn)V過(guò)率呈正相關(guān)。推測(cè)當(dāng)血清miR-4532、miR-2861表達(dá)降低時(shí)，對(duì)下游相關(guān)的炎癥介質(zhì)如IL-6和IL-18調(diào)控能力減弱，血清IL-6和IL-18的表達(dá)水平升高，激活血管內(nèi)皮炎癥活動(dòng)，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥損傷以及腎臟纖維化，最終導(dǎo)致腎功能下降和腎小球?yàn)V過(guò)率降低。此外，血清miR-4532、miR-2861表達(dá)與24 h尿蛋白定量、SLEDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，24 h尿蛋白定量、SLEDAI評(píng)分作為反映LN患者活動(dòng)性的指標(biāo)，上述結(jié)果提示血清miR-4532、miR-2861表達(dá)降低在介導(dǎo)炎癥損傷和腎臟纖維化的同時(shí)，還可以對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)膜造成損傷，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生和疾病的活動(dòng)性增加。

本研究ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-4532、miR-2861對(duì)LN的診斷效能均高。由于LN屬于自身免疫介導(dǎo)的,以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的疾病。而miR-4532、miR-2861能夠通過(guò)炎癥介質(zhì)IL-6和IL-18參與機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)，因此在LN的診斷和活動(dòng)性評(píng)估方面具有重要的作用，可以作為L(zhǎng)N的早期診斷和活動(dòng)性評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，miR-4532、miR-2861在LN患者血清中表達(dá)降低，其表達(dá)下降可以反映LN患者的炎癥反應(yīng)和疾病的活動(dòng)性，亦可以反映腎功能損傷情況，對(duì)LN臨床診斷和病情評(píng)估具有重要的應(yīng)用價(jià)值。