丁曉敏 胡海燕

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（上海200233）

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨腫瘤，其好發(fā)于兒童和青少年。骨肉瘤最常見的好發(fā)部位是長骨的干骺端，如股骨遠端及脛骨近端等［1］。由于醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，現(xiàn)通過新輔助化療、手術(shù)切除、輔助化療、靶向治療和免疫治療等多種方式聯(lián)合治療，原發(fā)性骨肉瘤患者的5年內(nèi)生存率已經(jīng)被提高到70%左右［2-3］。但是骨肉瘤極易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和早期轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移占據(jù)了骨肉瘤患者轉(zhuǎn)移部位的80%以上［4］。一旦發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，患者的5年內(nèi)生存率就降低至20%～30%。因此，探究骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制極為重要。

巨噬細胞炎癥蛋白4（macrophage inflammatory protein 4，MIP4）即趨化因子配體18（chemokine ligand 18，CCL18），屬于CC 趨化因子家族成員，與CCL13 分子結(jié)構(gòu)最為相似，CCL18 與其他巨噬細胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein，MIPs）一起位于17 號染色體上［5］。該基因本身有3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，但與其他趨化因子不同的是，CCL18 的第一個內(nèi)含子中包含2 個假外顯子（最終肽中不出現(xiàn)的外顯子）。通過這些假外顯子，人們認為MIP4/CCL18 是由CCL13 樣蛋白編碼基因之間的基因融合事件所產(chǎn)生的，并且由于積累突變，CCL18 隨著時間的推移獲得了不同的功能［6］。MIP4/CCL18 在不同的白介素因子刺激下與PITPNM3，GPR30，CCR8 等不同受體結(jié)合，在機體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮了各種作用［7］。除此之外，也有一些研究表明MIP4/CCL18 在多種腫瘤中高表達，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和進展相關(guān)，例如PINTO 等［8］發(fā)現(xiàn)MIP4/CCL18 在進展期的結(jié)直腸癌中高表達并介導(dǎo)了巨噬細胞分化、癌細胞侵襲這一過程。然而，MIP4/CCL18 在骨肉瘤中的研究鮮有報道。因此，本研究旨在評估MIP4/CCL18 在骨肉瘤原發(fā)組織和肺組織的表達情況，并探討其與患者的預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年1月至2013年12月來我院診治的骨肉瘤繼發(fā)肺轉(zhuǎn)移病人的原發(fā)灶腫瘤組織標本75例及配對的肺組織標本31例。所有患者均經(jīng)病理確診且病人信息完整。組織標本均來自手術(shù)和穿刺活檢，標本經(jīng)過4%甲醛固定后石蠟常規(guī)包埋。每個標本切片厚度是4 μm，連續(xù)切片不低于5 張。

1.2 方法及結(jié)果判定免疫組織化學(xué)采用SABC法進行染色，步驟參考試劑盒說明書。兔抗人一抗MIP4/CCL18 濃度為1∶100，山羊抗兔二抗?jié)舛葹?∶500。免疫組化試劑盒以及所有抗體均購于博士德生物工程有限公司。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標準：細胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒則為陽性，隨機選取五個視野在高倍鏡下觀察計數(shù)（1）染色強度評分：不著色0 分，黃色1 分，棕黃色2 分，黃褐色3 分；（2）陽性細胞所占比例評分：陽性細胞數(shù)≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分。最終結(jié)果以染色強度和染色范圍評分的乘機表示：陰性＝0 分，弱陽性＝1～4 分，陽性＝5～8 分，強陽性＝9～12 分，取中位值分為高表達組＞6 分，低表達組≤6 分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)資料類型，采用Spearman 相關(guān)分析分析MIP4/CCL18 在原發(fā)組織和肺組織中表達量的關(guān)系。采用卡方分析分析MIP4/CCL18 表達量與骨肉瘤臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier 生存分析及Cox 風險回歸模型分析判斷預(yù)后，當P＜0.05 時分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織中MIP4/CCL18 的表達在所有病例中，MIP4/CCL18 在原發(fā)灶中的表達為10.85 ±3.73，在肺轉(zhuǎn)移灶中的表達為8.51 ± 2.96。根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標準將所有患者的原發(fā)灶評分都計算出來，接著取中位值，患者被分為低表達組和高表達組（5.29 ± 0.95vs. 11.45 ± 4.24）（圖1）。

圖1 原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶CCL18 表達情況Fig.1 CCL18 expression in primary tissue and lung tissue

2.2 MIP4/CCL18 表達水平相關(guān)分析經(jīng)Spearman 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MIP4/CCL18 在骨肉瘤原發(fā)灶及其肺轉(zhuǎn)移灶中的表達具有相關(guān)性（r＝0.527，P＜0.05）。MIP4/CCL18 與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系見表1，卡方分析顯示，MIP4/CCL18 的表達量與患者的年齡、性別、腫瘤大小、壞死情況、病理類型及局部復(fù)發(fā)等方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但與臨床分期和發(fā)生肺轉(zhuǎn)移方面的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。利用Cox 風險回歸模型分析結(jié)果顯示，MIP4/CCL18 的表達量是骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移預(yù)后的獨立危險因素（OR＝1.307，P＜0.05）。

表1 骨肉瘤組織中CCL18 的表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between CCL18 expression and clinical features of OS samples

2.3 生存分析本研究的隨訪時間為6～36 個月，在所有75例患者中，35例因死亡而終止隨訪，其余40例至終點時仍生存。經(jīng)統(tǒng)計分析，MIP4/CCL18 高表達組患者的總生存率較低表達組患者組低（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

骨肉瘤的發(fā)展是一個多因素、多機制參與的復(fù)雜過程，早期易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移是其重要特點，也是影響患者生存預(yù)后的一大難題。目前，已有不少研究表明，腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)［9］。腫瘤相關(guān)巨噬細胞作為微環(huán)境的重要組成部分，其合成分泌的一系列細胞因子和趨化因子在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫抑制等生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用［10］，其中，M2 型巨噬細胞與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系尤為密切［11-12］。

圖2 CCL18 低表達和高表達患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of patients with low/high CCL18 expression

MIP4/CCL18 是一種由M2 型巨噬細胞分泌的趨化因子［13］，它在多種腫瘤組織中都具有高表達。PHAM 等［14］通過RT-qPCR 驗證了MIP4/CCL18在乳腺癌組織中的高表達情況并通過體內(nèi)異種移植模型驗證了MIP4/CCL18 可以通過觸發(fā)IL-32θ所抑制的通路來促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移。WANG 等［15］的研究證實了在食管癌組織中MIP4/CCL18 的高表達意味著患者會有更差的預(yù)后，而且MIP4/CCL18 通過上調(diào)HOTAIR 促進了食管鱗狀細胞癌的進展。ZHOU 等［16］則通過免疫組化檢測了MIP4/CCL18 在膽囊癌組織和正常組織的表達，揭示了MIP4/CCL18 在癌組織中的表達明顯高于正常組織，考慮其可能通過激活PI3K/Akt 這一信號通路來促使癌細胞發(fā)生遷移和侵襲。QIN 等［17］人用ELISA 檢測了132例頭頸部鱗狀細胞癌患者，25例癌前病變患者及32例健康受試者的血樣，發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細胞癌患者血樣中MIP4/CCL18 的水平高于其他人，并揭示了MIP4/CCL18 是通過MTDH-NF-κB 這條通路來促進癌細胞的轉(zhuǎn)移。不過，也有一些研究揭示了不同的現(xiàn)象。WU 等［18］發(fā)現(xiàn)胃癌早期患者外周血中MIP4/CCL18 的水平高于晚期。YUAN 等［19］分析了371例結(jié)腸癌患者癌組織中的MIP4/CCL18 表達水平，結(jié)果顯示MIP4/CCL18 高表達患者的總生存率較長，由此可見MIP4/CCL18 在腫瘤中的作用并不單一、絕對。

目前MIP4/CCL18 在多種腫瘤中的表達情況及作用機制相繼被揭示，但國內(nèi)外卻少有關(guān)于MIP4/CCL18 在骨肉瘤中的相關(guān)研究。本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測了骨肉瘤原發(fā)組織和肺轉(zhuǎn)移組織的MIP4/CCL18 表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶MIP4/CCL18 高表達者，其肺轉(zhuǎn)移灶的MIP4/CCL18 水平也會增高，接著筆者通過Spearman 相關(guān)分析證實了這兩者之間的相關(guān)性，后續(xù)的Cox 模型也表明了MIP4/CCL18 是影響骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移預(yù)后的獨立危險因素。曾經(jīng)LIU 等［20］的研究指出，MIP4/CCL18 通過結(jié)合其同源受體PITPNM3 來激活下游信號通路從而促進了乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，當MIP4/CCL18 與PITPNM3 的結(jié)合被阻斷后，雖然異種移植模型的腫瘤生長未停止，但是肺轉(zhuǎn)移卻得到了抑制，由此可見，MIP4/CCL18 是影響腫瘤侵襲和肺轉(zhuǎn)移的重要因子。接著，筆者在對75例骨肉瘤患者的臨床病理特征分析中發(fā)現(xiàn)，MIP4/CCL18 的表達水平與臨床分期及肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，生存期隨訪也顯示了MIP4/CCL18 高表達組患者的總生存率低于低表達組，這預(yù)示著MIP4/CCL18 可以在臨床上用作預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后的重要指標。

總之，MIP4/CCL18 在骨肉瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的過程中起著重要作用，它既可以作為提示骨肉瘤患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子，也對指導(dǎo)骨肉瘤患者的臨床預(yù)后有著重要的意義。不過，MIP4/CCL18促骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的具體機制仍有待進一步研究，之后才有望為骨肉瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。