曾玲娟 湯艷 喻玲 丁依玲 賴微斯 胡蕓

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科（長(zhǎng)沙410000）；2湖南省婦幼保健院B 超室（長(zhǎng)沙410008）

子癇前期是一種妊娠并發(fā)癥，嚴(yán)重危害產(chǎn)婦和嬰兒的健康，其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。臨床研究指出，胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡以及其侵襲力異常是造成子癇前期發(fā)病重要原因［1］。Survivin 是近幾年新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，Smac 與Survivin 之間具有緊密的聯(lián)系［2］，目前關(guān)于Survivin 是否參與子癇前期發(fā)病，相關(guān)研究較少。水通道蛋白9（aquaporin9，AQP9）在細(xì)胞的分化和遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，AQP9 顯示高表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞加速凋亡，其遷移能力降低，抑制細(xì)胞分化和融合，造成胎盤(pán)組織發(fā)生缺血缺氧［3］。有研究指出，子癇前期的發(fā)生發(fā)展主要和絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力下降有關(guān)，人類白細(xì)胞抗原G（human leukocyte antigen G，HLA-G）屬于HLA-Ⅰ類分子，對(duì)母體與胎兒的免疫耐能力起到誘導(dǎo)作用［4-5］。本文旨在研究Survivin、AQP9 和HLA-G 在子癇前期患者中的表達(dá)水平及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料本文選取2016年6月至2018年6月在我院就診的子癇前期患者50例，分為子癇前期組，年齡23～40 歲，平均（31.5 ± 5.1）歲，孕周30～40 周，平均（35.1±3.0）周；另外選取在我院進(jìn)行產(chǎn)檢的健康妊娠期產(chǎn)婦50例作為正常組，年齡22～38 歲，平均（30.5 ± 5.3）歲，孕周28～40 周，平均（34.8 ± 3.6）周。兩組研究對(duì)象在平均年齡、平均孕周上比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)；有完整的產(chǎn)檢記錄患者；正常孕婦無(wú)任何妊娠期合并癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除有嚴(yán)重心肺功能不全的患者；排除患有精神疾病的患者；排除病例資料不全的患者，畸形胎兒患者；患者孕前患有心血管疾病并且服用治療心血管的藥物患者。本次研究均得到所有研究對(duì)象及其家屬均知情，并簽署了家屬知情同意書(shū)，且經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)文號(hào)（2014）倫審批第（27）號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集搜集孕婦分娩5 min 內(nèi)留取臍帶根部的胎盤(pán)組織1 cm × 1 cm × 1 cm，使用生理鹽水將殘留的血液清洗干凈，之后使用濾紙將組織上的水分吸干，在凍存管中保存。

1.2.2 免疫透射比濁法檢測(cè)Survivin 表達(dá)水平取3 個(gè)試管，分別標(biāo)記為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管以及測(cè)定管?？瞻坠苤屑尤?5 μL 生理鹽水和350 μL Tris緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)管中加入15 μL CRP 定標(biāo)液和350 μL Tris 緩沖液，測(cè)定管中加入15 μL 待測(cè)標(biāo)本和350 μL Tris 緩沖液，對(duì)3 個(gè)試管分別搖晃混勻后，在37 ℃的環(huán)境中保存5 min，在波長(zhǎng)340～700 nm處讀各管吸光度。之后在3 個(gè)試管中分別加入羊抗人CRP 抗血清，分別搖晃混勻后在37 ℃的環(huán)境中保存5 min，在波長(zhǎng)340～700 nm 處讀各管吸光度，并對(duì)Survivin 水平進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)：50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10-20 μg/mL，在96孔酶標(biāo)板中加入100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜保存。第二天舍棄包被液，采用PBST 洗滌3 次，沒(méi)孔中加入1%的150 μL BSA，在37 ℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀釋度的血清，加入對(duì)照樣品，37 ℃孵育2 h。采用PBST 洗滌5 次，加入100 μL，稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST 洗滌5 次，之后，使用顯色劑顯色20 min 后，在酶標(biāo)儀上讀取A405 吸收值，從而測(cè)定AQP9和HLA-G的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（）進(jìn)行描述，兩組間比較采用實(shí)施獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 則說(shuō)明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 正常組、子癇前期組兩組Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平比較如表1 所示，子癇前期組患者Survivin、HLA-G 表達(dá)水平低于正常組，AQP9表達(dá)水平高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明Survivin、HLA-G 可能參與子癇前期疾病發(fā)生發(fā)展。

表1 兩組Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of Survivin，AQP9 and HLA-G expression levels in two groups ±s

表1 兩組Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of Survivin，AQP9 and HLA-G expression levels in two groups ±s

組別正常組子癇前期組t 值P 值例數(shù)50 50 Survivin 31.42±1.04 10.13±0.49 130.361 0.001 AQP9 0.19±0.01 0.65±0.03 103.186 0.001 HLA-G 50.69±3.05 27.35±1.23 50.137 0.001

2.2 Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平與子癇前期患者臨床相關(guān)性比較如表2 所示，Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平與子癇前期患者年齡、孕周無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。Survivin、AQP9 和HLA-G表達(dá)水平與子癇前期患者流產(chǎn)次數(shù)、病情嚴(yán)重程度有關(guān)（P＜0.05）。流產(chǎn)次數(shù)≥3 次、重度子癇患者Survivin、HLA-G 表達(dá)水平較低，AQP9 表達(dá)水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。說(shuō)明Survivin、HLA-G、AQP9 表達(dá)水平與子癇前期患者流產(chǎn)、子癇程度有關(guān)。

2.3 Survivin、AQP9 和HLA-G 之間的相關(guān)性分析如表3 所示，Survivin、AQP9 和HLA-G 之間進(jìn)行相關(guān)性分析，Survivin 和AQP9 之間呈負(fù)相關(guān)，AQP9 和HLA-G 之間之間呈負(fù)相關(guān)，Survivin 和HLA-G 之間之間呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。說(shuō)明Survivin、AQP9 和HLA-G 之間具有相關(guān)性，參與了子癇前期的發(fā)病過(guò)程。

表2 Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平與子癇前期患者臨床相關(guān)性比較Tab.2 Comparison of Survivin，AQP9 and HLA-G expression levels with clinical correlation in patients with preeclampsia±s

表2 Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平與子癇前期患者臨床相關(guān)性比較Tab.2 Comparison of Survivin，AQP9 and HLA-G expression levels with clinical correlation in patients with preeclampsia±s

臨床資料年齡（歲）流產(chǎn)次數(shù)（次）病情嚴(yán)重程度孕周（周）＜30≥30＜3≥3輕度子癇前期重度子癇前期＜35≥35例數(shù)26 24 15 35 28 22 25 25 Survivin 10.02±0.55 10.16±0.57 15.23±1.44 10.23±0.53 15.27±0.49 5.438±0.17 10.20±0.48 10.21±0.49 t 值0.902 18.062 90.093 0.092 P 值0.372 0.001 0.001 0.927 AQP9 0.61±0.03 0.63±0.04 1.02±0.06 0.67±0.02 1.09±0.20 0.22±0.02 0.71±0.04 0.69±0.04 t 值2.293 31.805 20.125 1.768 P 值0.026 0.001 0.001 0.083 HLA-G 27.34±1.47 27.56±1.32 35.78±2.12 28.72±0.76 38.46±1.34 20.06±0.94 28.38±0.51 28.11±0.98 t 值0.551 17.430 54.553 1.248 P 值0.584 0.001 0.001 0.218

表3 Survivin、AQP9 和HLA-G 之間的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis among Survivin，AQP9 and HLA-G

3 討論

在正常妊娠過(guò)程中，絨毛內(nèi)細(xì)胞會(huì)分化為合體滋養(yǎng)細(xì)胞以及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞。在妊娠早期，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞會(huì)脫離絨毛基底部，侵入蛻膜層及蛻膜組織，會(huì)取代血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)血管中層肌的彈力纖維產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈擴(kuò)張，實(shí)現(xiàn)子宮螺旋動(dòng)脈重鑄［6-7］。研究數(shù)據(jù)顯示，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力降低會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)缺乏，導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄出現(xiàn)障礙，全身血管內(nèi)皮受到損傷，造成子癇前期的病理以及生理表現(xiàn)［8］。

Survivin 屬于一種最強(qiáng)的凋亡抑制因子。研究［9-10］指出，Survivin 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的存活和增殖有一定的促進(jìn)作用，參與胚胎著床和胎盤(pán)發(fā)育，有助于維持產(chǎn)婦正常妊娠。Survivin 表達(dá)異常與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡及侵襲有關(guān)，造成胎盤(pán)絨毛發(fā)育不良，導(dǎo)致胎盤(pán)缺血以及缺氧，對(duì)新生兒的體重以及胎盤(pán)質(zhì)量產(chǎn)生直接的影響，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致新生兒和產(chǎn)婦死亡［11-12］。本文研究結(jié)果顯示，子癇前期患者的胎盤(pán)組織中，Survivin 表達(dá)水平降低，說(shuō)明Survivin能夠?qū)θ焉锲诋a(chǎn)婦的情況進(jìn)行表達(dá)，可能參與了疾病的發(fā)病過(guò)程。周小娜［13］研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期組患者的胎盤(pán)組織中Survivin 表達(dá)水平下降，與本文研究保持一致。因?yàn)镾urvivin 表達(dá)水平降低造成滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力與細(xì)胞侵襲性降低，滋養(yǎng)細(xì)胞大量凋亡，導(dǎo)致胎盤(pán)著床較淺，胎盤(pán)組織缺乏血液供應(yīng)，表明Survivin 參與子癇前期的發(fā)?。?4-15］。

重度子癇前期患者的AQP9 表達(dá)水平高于輕度子癇患者，AQP9 參與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)程，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，造成胎盤(pán)缺氧，導(dǎo)致患者發(fā)病［16］。研究發(fā)現(xiàn)，在羊膜上皮細(xì)胞中AQP9 水平與正常妊娠孕婦已經(jīng)妊娠高血壓患者相比，其表達(dá)水平較高［17］。本文研究數(shù)據(jù)顯示，子癇前期患者的胎盤(pán)組織中，AQP9 表達(dá)水平升高，推測(cè)AQP9參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展，AQP9 表達(dá)異常在胎盤(pán)組織滋養(yǎng)細(xì)胞中作用更加重要。HLA-G 表達(dá)水平下降會(huì)造成滋養(yǎng)細(xì)胞受到母體免疫細(xì)胞攻擊，導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄受到阻礙，胎盤(pán)缺氧，最終子癇前期發(fā)生［18-19］。本文結(jié)果顯示，子癇前期患者的胎盤(pán)組織中，HLA-G 表達(dá)水平降低，說(shuō)明HLA-G參與子癇前期發(fā)病過(guò)程。駱守玲［20］研究顯示，子癇前期患者血清中HLA-G 水平與HLA-GmRNA 呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明，HLA-G 參與了胎盤(pán)組織相應(yīng)血管的生理性變化。

本文研究數(shù)據(jù)顯示，流產(chǎn)次數(shù)≥3 次、重度子癇患者Survivin、HLA-G 表達(dá)水平較低，AQP9 表達(dá)水平較高，說(shuō)明Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)水平與子癇前期患者流產(chǎn)次數(shù)、病情嚴(yán)重程度有關(guān)，Survivin、HLA-G 表達(dá)隨著子癇前期患者病情進(jìn)展降低，AQP9 表達(dá)隨著子癇前期患者病情進(jìn)展升高。本文研究數(shù)據(jù)顯示，AQP9 和Survivin、HLA-G之間具有負(fù)相關(guān)性，當(dāng)AQP9 表達(dá)升高時(shí)，Survivin、HLA-G 受到抑制，Survivin、AQP9 和HLA-G參與了子癇前期的發(fā)展，在子癇前期中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，Survivin、AQP9 和HLA-G 表達(dá)與子癇前期具有相關(guān)性，Survivin、AQP9 和HLA-G 的異常表達(dá)，參與了子癇前期的發(fā)展，在子癇前期的臨床診斷中具有重要意義。