孫 婷, 柏海燕, 呂淑蘭, 王 麗

(1. 西北婦女兒童醫(yī)院 生殖中心, 陜西 西安, 710003;2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 陜西 西安, 710061)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡女性中常見的內(nèi)分泌及代謝性疾病，是導(dǎo)致女性不孕的重要因素。排卵功能紊亂或無排卵、高雄激素血癥是PCOS的主要特征，也是造成PCOS患者不孕的主要原因[1]。目前, PCOS的發(fā)病機制尚未完全明確，已有大量研究[2-3]證實, PCOS患者體內(nèi)出現(xiàn)的內(nèi)分泌及代謝紊亂會影響子宮內(nèi)膜容受性，從而導(dǎo)致不孕。同時有研究[4-5]證實, PCOS患者處于非特異性炎癥反應(yīng)及免疫功能失調(diào)狀態(tài)，非特異性炎癥反應(yīng)及Th1/Th2表達(dá)失衡在PCOS發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。為進(jìn)一步了解PCOS合并不孕的發(fā)生及發(fā)展與機體炎癥反應(yīng)和免疫狀態(tài)的相關(guān)性，本研究探討了健康女性與PCOS患者血清性激素、非特異性炎癥因子及Th1/Th2表達(dá)水平，并分析其相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月—2019年1月本院生殖中心門診收治的72例PCOS不孕患者作為觀察組，同時采用分層抽簽法從同期體檢的正常非妊娠期育齡女性中抽選出50例作為對照組。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)符合以下3個條目中2條即可診斷[6]: ① 長期無排卵; ② 雄性激素測定水平高于正常值; ③ 卵巢體積增大，單側(cè)卵巢>10 mL, 或卵巢中存在數(shù)量超過12個直徑2～9 mm的卵泡。納入標(biāo)準(zhǔn): 符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn); 年齡20～42歲; 體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18.5～24.0 kg/m2; 意識清晰，依從性良好。對照組既往存在正常生育史，無流產(chǎn)或死胎史; 明確研究內(nèi)容且簽署協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn): 近半年內(nèi)接受過任何激素治療及糖皮質(zhì)激素等影響炎性因子的藥物治療；甲狀腺及腎上腺等其他內(nèi)分泌疾病。對照組年齡23～42歲，平均(29.41±3.26)歲; BMI 18.9～23.6 kg/m2, 平均(21.13±0.86) kg/m2。觀察組年齡21～42歲，平均(29.62±3.23)歲; BMI 18.6～23.9 kg/m2, 平均(21.26±0.81) kg/m2。2組年齡及BMI分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測方法

月經(jīng)周期第2～4天時，采集晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血樣3份各3 mL。其中1份離心，分離血清，用于對雌二醇(E2)、卵泡生成激素(FSH)、黃體生成激素(LH)、睪酮(T)等性激素的測定，測定方法選擇化學(xué)發(fā)光法; 1份離心、分離血清，用于非特異性炎癥因子C反應(yīng)蛋白(CRP)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6測定，測定方法選擇酶聯(lián)免疫吸附法，操作過程均按照試劑盒(上海通蔚實業(yè)有限公司)使用說明書進(jìn)行。另1份加入裝有肝素的抗凝管中，采用等體積的Hank′s溶液進(jìn)行稀釋，密度梯度離心5 min, 分離收集外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)懸液并保存，用于Th1、Th2含量測定，具體操作如下。

采用美國貝克曼流式細(xì)胞儀將上述PBMCs懸液加入流式管中，采用PerCP-CD3、ACP-CD4和PE-IFN-γ、FITC-IL-4熒光抗體對懸液中相應(yīng)細(xì)胞做常規(guī)染色處理，在4 ℃低溫條件下避光染色25 min后洗去游離抗體; 隨后使用100 μL磷酸鹽緩沖鹽溶液對細(xì)胞進(jìn)行重懸; 最后采用流失細(xì)胞儀進(jìn)行Th1(CD3+、CD4+、IFN-γ、Th1)和Th2(CD3+、CD4+、IL-4、Th2)細(xì)胞亞群含量測定，計算Th1/Th2比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2組性激素水平比較

與對照組比較，觀察組E2、LH、T、LH/FSH含量均顯著升高(P<0.05), 但2組FSH含量變化無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 2組性激素水平比較

E2: 雌二醇; FSH: 卵泡生成激素; LH: 黃體生成激素; T: 睪酮。與對照組比較, *P<0.05。

2.2 2組研究對象外周血非特異性炎性因子水平比較

與對照組比較，觀察組CRP、IFN-γ、TNF-α、IL-6含量均顯著升高(P<0.05), 但I(xiàn)L-4水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組外周血非特異性炎性因子水平比較

CRP: C反應(yīng)蛋白; IFN-γ: 干擾素-γ; IL: 白介素; TNF-α: 腫瘤壞死因子-α。與對照組比較, *P<0.05。

2.3 2組Th1、Th2含量比較

與對照組比較，觀察組Th1含量和Th1/Th2比值增加(P<0.05), 但Th2含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 性激素水平與外周血非特異性炎性因子水平、Th1、Th2相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)系數(shù)法分析顯示，觀察組性激素指標(biāo)E2、LH/FSH、T表達(dá)水平與CRP、IFN-γ、TNF-α、IL-6及Th1/Th2比值呈顯著正相關(guān)(P<0.05); 但E2、LH/FSH、T表達(dá)水平均與IL-4水平無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表3 2組Th1、Th2含量比較

與對照組比較, *P<0.05。

表4 性激素水平與外周血非特異性炎癥因子水平相關(guān)性

CRP: C反應(yīng)蛋白; IFN-γ: 干擾素-γ; IL: 白介素; TNF-α: 腫瘤壞死因子-α; E2: 雌二醇; FSH: 卵泡生成激素; LH: 黃體生成激素; T: 睪酮。

3 討 論

PCOS是育齡女性發(fā)病率較高的內(nèi)分泌疾病，在無排卵女性中發(fā)病率為50.00%～70.00%。PCOS基礎(chǔ)病理研究[7]發(fā)現(xiàn), PCOS的生理病理改變從圍青春期就已開始，且隨著年齡增長會導(dǎo)致月經(jīng)不調(diào)、肥胖、多毛、無排卵性不孕不育、高胰島素血癥等疾病發(fā)生，持續(xù)性激素刺激甚至?xí)?dǎo)致乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等病變。據(jù)研究[8]資料顯示, PCOS患者主要為年齡≤35歲的女性，排卵功能障礙為其最主要的臨床特征, 83.80%的PCOS患者因不孕而就診。PCOS發(fā)病機制復(fù)雜，種族因素、環(huán)境因素、飲食等是目前被廣泛提及的影響其發(fā)病的因素。有研究提出，下丘腦-垂體-卵巢性腺軸功能紊亂與其發(fā)病具有顯著相關(guān)性。潘愛珍等[9]研究顯示, PCOS模型大鼠血清中LH、LH/FSH、T水平顯著上升。本研究測定結(jié)果顯示，觀察組患者血清E2、LH、T、LH/FSH比值顯著高于對照組。這提示PCOS患者體內(nèi)存在顯著性激素紊亂，其可能是導(dǎo)致BMI正常的PCOS患者不孕的主要原因[10]。越來越多研究[11-12]顯示, PCOS患者體內(nèi)可能存在慢性炎癥反應(yīng)，且其發(fā)病及病情進(jìn)展可能與自身免疫功能有關(guān)。慢性非特異性炎癥反應(yīng)屬于免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的慢性亞臨床炎癥反應(yīng)，患者無紅腫熱痛等全身或局部性臨床表現(xiàn)，主要以多種促炎介質(zhì)的持續(xù)性升高為特點。炎癥介質(zhì)不僅參與感染性疾病的進(jìn)展，而且在多種內(nèi)分泌疾病和免疫性疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)異常，可對卵泡上皮細(xì)胞內(nèi)分泌功能造成影響，通過上調(diào)雌激素合成分泌，下調(diào)下丘腦-垂體-卵巢軸對孕激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)來影響孕激素的分泌。同時，炎癥介質(zhì)還可通過各種途徑介導(dǎo)胰島素抵抗作用，從而參與PCOS發(fā)生、發(fā)展過程。

CRP是血管壁炎癥病變的獨立標(biāo)志物，也是預(yù)測動脈粥樣硬化性心臟病等疾病的良好因子。多項研究[13]提示, CRP表達(dá)水平升高可能與心血管疾病發(fā)生有關(guān)，可大大提高PCOS患者并發(fā)心血管疾病的風(fēng)險。TNF-α主要是T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，可刺激IL-6的合成、分泌。TNF-α和IL-6水平升高又可刺激肝臟對CRP的合成分泌，從而抑制胰島素分泌。以往報道[14]顯示, PCOS患者血清TNF-α水平顯著高于健康女性，高水平TNF-α可通過降低脂聯(lián)素型號傳導(dǎo)和GLUT-4蛋白，從而影響胰島素分泌功能，這也是導(dǎo)致肥胖女性子宮內(nèi)膜功能失敗的原因。IL-6屬于多功能性細(xì)胞因子，不僅參與機體能量代謝、生殖細(xì)胞生長發(fā)育，還涉及機體炎癥反應(yīng)。多項研究[15-16]證實，機體循環(huán)系統(tǒng)中高水平IL-6是胰島素抵抗綜合征的獨立預(yù)測因子，且其隨著體質(zhì)量增加而升高。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血CRP、IFN-γ、TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著高于健康對照組，且其表達(dá)水平與性激素E2、LH/FSH、T表達(dá)水平存在顯著正相關(guān)。CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞對卵泡顆粒細(xì)胞的浸潤，損傷細(xì)胞膜完整性，影響孕激素羥基末端的修飾性磷酸化反應(yīng)。通過抑制孕激素的分泌，促進(jìn)雌性激素的大量合成及分泌，從而抑制機體卵泡的成熟[17-18]。同時，炎癥細(xì)胞會對性激素表達(dá)產(chǎn)生影響，如雄激素可提高淋巴細(xì)胞產(chǎn)生分泌因子IFN-γ/IL-4比值，但雌激素則會抑制此反應(yīng)。此外，女性性激素分泌功能紊亂還會導(dǎo)致機體免疫表達(dá)異?！，F(xiàn)代研究認(rèn)為，性激素會影響細(xì)胞因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，進(jìn)而減弱或增強相應(yīng)的免疫應(yīng)答。

PCOS患者外周血中單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著增加，導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫表達(dá)增強。同時，卵巢組織病理學(xué)檢查顯示，巨噬細(xì)胞及Lym出現(xiàn)顯著浸潤[19]。Th1、Th2細(xì)胞是分泌功能及生物學(xué)功能不同的2種輔助性T細(xì)胞。Th1主要分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，促進(jìn)機體細(xì)胞免疫; Th2則主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等，參與體液免疫。其中Th2分泌的IL-4可促使Th0向Th2細(xì)胞分化，從而減少機體內(nèi)Th1細(xì)胞數(shù)量。正常生理狀態(tài)下，Th1和Th2水平保持動態(tài)平衡，從而維持機體正常的體液及細(xì)胞免疫功能。有研究[20]指出，其動態(tài)平衡與妊娠情況具有顯著相關(guān)性。鄒麗等[21]報道顯示, PCOS患者血清炎癥因子IL-1β、hs-CRP、IL-6、TNF-α和免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平均與其排卵率及1年內(nèi)的妊娠率呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究通過流失細(xì)胞技術(shù)測定發(fā)現(xiàn), BMI正常的PCOS患者外周血中Th1含量和Th1/Th2比值增加，該結(jié)果與鐘興明等報道結(jié)果一致。同時，本研究中Th1/Th2比值與性激素E2、LH/FSH、T表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。提示BMI正常PCOS不孕患者體內(nèi)可能存在免疫功能紊亂。

綜上所述, BMI正常的PCOS患者體內(nèi)可能存在程度較強的慢性非特異性炎癥反應(yīng), Th1/Th2比值增加可能導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，這均可能與患者體內(nèi)性激素功能紊亂具有密切關(guān)聯(lián)，但具體作用機制有待進(jìn)一步研究。