范晉海 蔣玉梅 張 靜 白曉靜

膀胱癌是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，晚期膀胱癌患者預(yù)后較差，5年生存率低于50%[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)新發(fā)膀胱癌53 670例，有將近43 090例患者出現(xiàn)死亡，膀胱癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，其因腫瘤死亡順位排第十位[3]。由于膀胱癌起病隱匿，往往患者就診時(shí)就已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且膀胱癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制十分復(fù)雜，使得患者缺乏有效的治療從而導(dǎo)致患者預(yù)后極差[4]。因此，探究膀胱癌的發(fā)病機(jī)理、尋找膀胱癌早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物對(duì)膀胱癌的診斷、治療以及預(yù)后評(píng)估具有重要意義[5]。微管相關(guān)蛋白1A(Microtubule associated protein 1A，MAP1A)作為微管相關(guān)蛋白(Microtubule-associated proteins，MAPs)的一個(gè)家族成員，其基本功能是參與微管組裝，增加微管的穩(wěn)定性，在細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[6]。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MAP1A參與了多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其表達(dá)改變影響患者預(yù)后[7]。目前有關(guān)MAP1A在膀胱癌中的作用未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本研究回顧性分析2013年1月—2017年12月于我院行根治膀胱全切術(shù)患者137例，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)MAP1A在膀胱癌中的表達(dá)，并分析MAP1A表達(dá)與膀胱癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在為膀胱癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集2011年1月—2016年1月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科收治的根治膀胱全切術(shù)并經(jīng)過(guò)病理證實(shí)的膀胱癌組織137例(包括20例新鮮膀胱癌組織及其配對(duì)的癌旁組織，余117例石蠟塊標(biāo)本)，所有137例癌組織和137癌旁組織均為一一配對(duì)，癌旁組織選擇距癌灶邊緣5 cm以上，其中男89例，女48例；<60歲64例，≥60歲73例，平均年齡64.7±12.5歲；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期84例，Ⅲ～Ⅳ期53例。收集137例膀胱癌患者的臨床資料以電話和(或)查閱病歷的方式進(jìn)行隨訪調(diào)查，了解患者術(shù)后死亡時(shí)間及原因，所有納入的患者均獲得隨訪數(shù)據(jù)；隨訪起始時(shí)間從手術(shù)時(shí)間開(kāi)始，到患者死亡時(shí)間，截止到2019年1月1日?？偵嫫?Overall survival，OS)是指從手術(shù)之日開(kāi)始或出院之日開(kāi)始至因任何原因死亡或末次隨訪日期。無(wú)病生存期(Disease-free survival，DFS)是指從隨機(jī)化開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間。所有納入患者臨床資料均完整，本研究均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用TRIZol?RNA提取試劑提取膀胱癌組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，設(shè)置轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，98℃ 5 min。采用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。MAP1A及GAPDH引物由湖南擎科生物有限公司提供，MAP1A上游序列5′-ATGGCGGATGAAGTAATCGCG-3′，下游序列5′-CCAGAACTCACCATGGATCAG-3′；GAPDH上游序列5′-TCCCTCGTGCTAGATCATGAA-3′，下游序列5′-GGTCATGATCAGCCACTGTC-3′。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃ 35 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次；計(jì)算各組CT值，以2-△△Ct計(jì)算MAP1A的表達(dá)水平。

1.3 免疫組織化學(xué)法

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-perosidase，SP)法檢測(cè)MAP1A表達(dá)，石蠟塊使用二甲苯脫石蠟，連續(xù)切4 μm厚的切片，將切片置于載玻片上，其后梯度乙醇水化脫蠟切片，3%的過(guò)氧化氫離子水用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗滌，高溫高壓修復(fù)切片10 min，隨后滴加兔抗人MAP1A一抗(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，第二日加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照采用等量的PBS代替一抗。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定

結(jié)果判讀由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片，最終免疫組化評(píng)分根據(jù)染色的強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比的兩項(xiàng)乘積進(jìn)行綜合評(píng)分，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，1%～25%評(píng)1分，26%～50%評(píng)2分，>51%評(píng)3分。MAP1A表達(dá)強(qiáng)度的總分評(píng)判：>4分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MAP1A在膀胱癌組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，與配對(duì)的癌旁組織相比，MAP1A在新鮮膀胱癌組織中表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.022，P<0.0001)(圖1)；另外，通過(guò)免疫組化結(jié)果表明，MAP1A在膀胱癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為46.71%，MAP1A在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為79.56%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)(表1，圖2)。

圖1 MAP1A在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 MAP1A在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 MAP1A表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系

膀胱癌組織中MAP1A的表達(dá)與患者的臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度均無(wú)相關(guān)性(表2)。

2.3 MAP1A的表達(dá)與膀胱癌患者生存期的關(guān)系

通過(guò)Kaplan-Meier分析MAP1A表達(dá)與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAP1A低表達(dá)組患者的OS和DFS較MAP1A高表達(dá)患者明顯縮短(P<0.0001)。提示MAP1A表達(dá)越高，膀胱癌患者預(yù)后越差(圖3)。單因素Cox回歸分析表明，T分期、N分期、TNM分期和MPA1A表達(dá)是膀胱癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)；而Cox多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)TNM分期和MPA1A表達(dá)是影響膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表3)。

圖3 MAP1A表達(dá)與膀胱癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系

表1 MAP1A在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

表2 MAP1A表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 影響膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素的單因素和多因素分析

3 討論

MAPs包含結(jié)合微管的結(jié)構(gòu)域和向外突出的結(jié)構(gòu)域與其他細(xì)胞成分結(jié)合的2種結(jié)構(gòu)，MAPs與微管蛋白相互結(jié)合組成微管參與細(xì)胞多種重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞正常形態(tài)的維持、細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)萚8]。微管相關(guān)蛋白1(MAP1)是MAPs蛋白家族中的重要成員，其包含由3個(gè)不同基因編碼的MAP1A、MAP1B和MAP1S[9]。MAP1A主要表達(dá)在成人神經(jīng)元中并且主要分布于樹(shù)突，在微管組裝、調(diào)節(jié)微管運(yùn)動(dòng)控制細(xì)胞分裂及對(duì)軸突、樹(shù)突的形成發(fā)展發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白表達(dá)異常，引起癌細(xì)胞內(nèi)微管動(dòng)態(tài)系統(tǒng)的失衡；鑒于MAP1參與微管結(jié)構(gòu)的組成，其在多種實(shí)體腫瘤進(jìn)展也扮演重要角色[11]。

Meyer等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾MAP1A的表達(dá)后，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖能力明顯降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。Song等[13]學(xué)者通過(guò)隨機(jī)收集33例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的癌及癌旁組織，檢測(cè)TGFβ與自噬標(biāo)記物MAP1A和LC3的相關(guān)性。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，TGFβ、MAP1A和LC3在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中顯著升高；TGFβ可通過(guò)增強(qiáng)MAP1A介導(dǎo)的自噬作用抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)MAP1S介導(dǎo)的細(xì)胞自噬可抑制前列腺癌患者的腫瘤發(fā)生；且MAP1A低表達(dá)的前列腺癌患者比MAP1A高表達(dá)的患者生存期短，MAP1A的表達(dá)水平可作為前列腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。Knutson等[15]學(xué)者報(bào)道指出，MAP1A在乳腺癌細(xì)胞T47D和MCF-7中高表達(dá)，其作為孕酮受體(Progesterone receptors，PR)的下游靶基因，可作為預(yù)測(cè)乳腺癌早期轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的標(biāo)志物。

本研究顯示，相比于配對(duì)的癌旁正常膀胱組織，MAP1A蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。免疫組化結(jié)果表明，比較MAP1A在膀胱癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明其可能成為提高膀胱癌診斷率的一種新型標(biāo)志物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中MAP1A的表達(dá)與患者的臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與患者性別、年齡、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度均無(wú)相關(guān)性。由此提示MAP1A與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與了膀胱癌的惡性進(jìn)程。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)MAP1A低表達(dá)組患者的OS和DFS明顯短于高表達(dá)組患者。提示MAP1A表達(dá)水平與膀胱癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，即MAP1A表達(dá)越高，膀胱癌患者預(yù)后越差。最后，我們通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Cox多因素回歸結(jié)果顯示，TNM分期和MPA1A表達(dá)是影響膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果與Jiang等[14]的研究結(jié)論相類(lèi)似，MAP1A低表達(dá)患者提示患者預(yù)后較差。結(jié)合上述結(jié)果表明，MAP1A在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要的角色，其在膀胱癌中低表達(dá)提示患者不良預(yù)后，可成為膀胱癌預(yù)后評(píng)估潛在的分子標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中MAP1A低表達(dá)與患者惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)，但MAP1A參與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制還需后續(xù)深入研究。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，MAP1A大多參與細(xì)胞自噬過(guò)程，這將提示我們的機(jī)制方向?qū)⒅攸c(diǎn)研究MAP1A介導(dǎo)細(xì)胞自噬參與膀胱癌的進(jìn)展。