劉耿淳 申良方

鼻咽癌是一種在中國南方發(fā)病率較高的惡性腫瘤，被認為是由愛潑斯坦-巴爾(EB)病毒感染和其他環(huán)境因素引起。早期治療鼻咽癌效果較好，5年生存率達85%[1-3]。然而，由于早期臨床癥狀不典型、不明顯，加上鼻咽癌病變較深且與顱底密切相關，鼻咽癌易遷移至顱底、咽旁區(qū)、頸動脈鞘等周圍組織，因此，探尋早期鼻咽癌診治分子標志物具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)被定義為長于200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA參與基因表達的多級調控，包括表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平。異常的lncRNA通過促進轉錄調節(jié)驅動癌癥[4-5]。lncRNA在癌癥相關基因調控系統(tǒng)中起關鍵作用，其表達紊亂可促進癌細胞增殖、侵襲和轉移。最近研究已證實lncRNA在血清或血漿中以可測量的水平存在，具有高穩(wěn)定性，使其成為有前景的生物標志物[6]。血清循環(huán)RNA MALAT1可以區(qū)分肝癌患者和健康對照，并且AFAP1-AS1可以作為用于胃癌診斷和預后預測的新型血清生物標志物。本研究擬探討血清lncRNA MALAT1和AFAP1-AS1與鼻咽癌臨床病理特征和預后的關系，為鼻咽癌的診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2013年4月—2015年6月在中南大學湘雅醫(yī)學院第六臨床醫(yī)院經病理證實的鼻咽癌患者136例為研究對象，符合美國國家綜合癌癥網(National Compre hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCNCRC診治指南》中的診斷標準。鼻咽癌患者中男70例，女66例，年齡27～72歲，平均(55.45±5.63)歲。根據2008 TNM鼻咽癌分期系統(tǒng)，Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期48例，Ⅳa期20例，Ⅳb期11例。所有患者均通過組織病理學診斷確診，并進行了明確的TNM分期。該研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署書面知情同意書。在涉及人類參與者的研究中進行的所有程序均符合國家研究委員會的道德標準和赫爾辛基宣言中的道德標準。選擇我院2015年1月—5月的門診健康體檢者54例為對照組，其中男25例，女29例，年齡26～70歲，平均(55.87±5.14)歲。鼻咽癌組及對照組自愿提供血清，用于分析lncRNA MALAT1和AFAP1-AS1的表達及其與臨床病理特征的關系。排除標準：其他腫瘤患者；參與者重要內臟器官的功能障礙或失敗，包括肝臟、腎臟、心臟等；參與者在研究前進行了放化療。

1.2 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表達水平的測定

使用TRIzol Reagent提取血清總RNA。使用SMA 400 UV-vis檢測分離的RNA的濃度和純度。使用逆轉錄系統(tǒng)試劑盒從RNA樣品合成互補DNA(cDNA)。使用標準SYBR Green PCR試劑盒方案和在CFX96實時上的TaqMan miRNA測定進行l(wèi)ncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的實時PCR。lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表達結果通過內參基因GAPDH均一化，并通過2-ΔΔCt方法計算。本試驗中特異性引物如下：MALAT1上游序列5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下游序列5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；AFAP1-AS1上游序列5′-CTAGTCTAGAGTCGCTGTTAT CTCATTGTCTG-3′，下游序列5′-CGCGGATCCT CTGCTTCTGTCACAGAATC-3′；GAPDH上游序列5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，下游序列5′-TG TATCCAAACTCATTG TCATAC-3′。定量PCR的反應條件如下：95℃10 min，45個循環(huán)，95℃20 s，60℃30 s，72℃20 s。PCR體系為：10 μL 2×QuantiTect SYBR Green RTPCR Master Mix、1.0 μL正向和反向引物(0.5 μm/L)、2 μg模板RNA、0.5 μLQuantiTectRT Mix和dd H2O。為分析lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表達水平與鼻咽癌患者臨床病理特征關系，定義2-ΔΔCt≤2為低表達，2-ΔΔCt>2為高表達[7]。

1.3 隨訪

隨訪開始日期為出院日期，隨訪結束日期為2018年12月31日，隨訪方式為門診及電話隨訪，隨訪內容為患者出院后生存狀況，終點事件為死亡、隨訪時間截止及刪失，總生存期(OS)為出院至出現(xiàn)終點事件時間。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 對照組和鼻咽癌組中l(wèi)ncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平的表達

與對照組比較，鼻咽癌組lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達水平明顯升高(P<0.001)(表1)。

2.2 鼻咽癌患者lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達與臨床病理特征的關系

lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達與年齡無關(P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移、復發(fā)有關(P<0.05)，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發(fā)的鼻咽癌患者lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達率越高(表2)。

2.3 lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達水平與患者預后分析

lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達組2年生存率及總生存期均明顯高于lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達組(P<0.001)(圖1，表3)。

表1 對照組和鼻咽癌組中l(wèi)ncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平的表達

表2 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系

表3 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1蛋白表達水平與患者預后分析

圖1 lncRNA MALAT1/AFAP1-AS1高表達組與低表達組Kaplan-Meier生存曲線比較

2.4 預后多因素分析

將患者年齡、腫瘤直徑、病理學分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移與否等臨床特征及KPS評分和血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達等變量納入多因素Cox逐步回歸分析，結果發(fā)現(xiàn)年齡≥50歲(HR=1.92，95%CI：1.06～3.46)和病理級別Ⅲ～Ⅳ級(HR=3.70，95%CI：2.08～6.61)為鼻咽癌患者OS的獨立危險因素，lncRNA MALAT1低表達(HR=0.52，95%CI：0.37～0.81)和lncRNA AFAP1-AS1低表達(HR=0.56，95%CI：0.51～0.83)為鼻咽癌患者OS的獨立保護因素(P<0.001)(表4)。

表4 鼻咽癌患者OS多因素逐步Cox回歸分析結果(n=136)

3 討論

越來越多的證據表明，真核轉錄組和基因組不是蛋白質編碼基因轉錄的簡單底物，lncRNA才是。lncRNA可能作為致癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。已發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達經常在癌細胞中失調[8]。

lncRNA MALAT1基因長度為2.6 kb，由4個外顯子組成。lncRNA MALAT1成為編程分化細胞轉變?yōu)槎嗄芨杉毎闹匾獏⑴c者。lncRNA MALAT1可促進肝細胞癌、乳腺癌、乳腺干細胞和神經膠質瘤的進展。lncRNA MALAT1通過阻止細胞應激途徑(包括p53反應)的激活在調節(jié)乳腺癌中起關鍵作用[9-10]。lncRNA MALAT1是缺氧反應性lncRNA，其通過miR-145參與肝細胞癌中缺氧信號傳導。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞的過度增殖密切相關[11-12]。由于癌細胞增殖過程中消耗大量氧氣，缺氧是腫瘤發(fā)展的常見原因。缺氧可使癌細胞改變其生物學行為以適應缺氧環(huán)境，從而增加其侵襲性和轉移潛能。在這種情況下，癌細胞生長所需的能量主要來自無氧糖酵解。因此，隨著癌細胞轉移的進展，lncRNA MALAT1的表達繼續(xù)增加以滿足癌組織中葡萄糖代謝的需求。lncRNA MALAT1是跨膜葡萄糖輸入的重要細胞載體，并且是葡萄糖轉運的重要調節(jié)因子；在正常組織或良性腫瘤中未檢測到lncRNA MALAT1表達，而在惡性腫瘤中通常發(fā)現(xiàn)高水平的lncRNA MALAT1，其機制是lncRNA MALAT1增加葡萄糖攝取和轉運[13-14]。因此，lncRNA MALAT1被認為是細胞惡性腫瘤的早期標志物之一。目前，大量研究表明lncRNA MALAT1在多種腫瘤中過表達，其表達水平與臨床分期和轉移密切相關。

在大多數鼻咽癌患者中發(fā)現(xiàn)持續(xù)潛伏的EB病毒感染，表明其在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中的病因學作用。AFAP1-AS1是一種新鑒定的lncRNA。AFAP1-AS1的高表達與鼻咽癌患者的轉移和預后不良有關[15-16]。因此，AFAP1-AS1可能是鼻咽癌診斷生物標志物和預后因素。研究發(fā)現(xiàn)EB病毒感染后NP69細胞中AFAP1-AS1的水平顯著增加。AFAP1-AS1最初被鑒定為非小細胞肺癌的預后標志物，然后發(fā)現(xiàn)在一系列腫瘤類型中上調。AFAP1-AS1通過充當miR-25的靶基因進而促進肝癌的發(fā)生和進展。體外細胞試驗表明，AFAP1-AS1敲低抑制了NPC細胞的轉移、體外侵襲和增殖。進一步的qRT-PCR檢測顯示AFAP1-AS1影響與轉移、侵襲和細胞周期相關的基因的表達。這說明AFAP1-AS1參與鼻咽癌進展過程[17-18]。

本研究結果顯示，與對照組比較，鼻咽癌組lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達明顯升高；lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達與腫瘤最大徑、病理學分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移、復發(fā)相關，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發(fā)，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達率越高。這與上述討論癌組織中MALAT1、AFAP1-AS1高表達相符合，同時說明鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平升高，且與鼻咽癌惡性進展有關。與此同時，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達組2年生存率及總生存期均明顯高于lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達組；多因素Cox回歸分析顯示，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達為鼻咽癌患者預后的保護因素，說明血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達的鼻咽癌患者預后良好。

本研究實驗樣本偏少，且未探討MALAT1、AFAP1-AS1與鼻咽炎發(fā)病的分子機制聯(lián)系，這將在后續(xù)研究中完善。綜上所述，鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平升高，且與鼻咽癌惡性進展有關；鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達患者預后良好；MALAT1、AFAP1-AS1有望診斷鼻咽癌的新型標志物。