李傳海 劉 玉 王延群 陳英劍

ABL2(也稱Abl相關(guān)基因，Arg)最初在白血病中被鑒定為致癌基因[1]，是非受體酪氨酸蛋白激酶Abelson家族的一員，其通過C末端F-肌動蛋白和微管結(jié)合序列在細胞骨架重排、細胞生長、存活、侵襲、黏附和遷移中發(fā)揮著重要作用[2-5]。在多種癌癥中都檢測到ABL2表達水平和活性的升高[6-7]，ABL2可以磷酸化cortactin蛋白，從而促進侵襲性癌細胞的遷移[8-9]。最新研究表明，ABL2的失活會抑制非小細胞肺癌向腦和骨以及其它器官的轉(zhuǎn)移[10]，但是尚未完全闡明其作用機制。本研究旨在探究ABL2在肺腺癌A549細胞中的作用，并闡明其在肺癌中發(fā)揮作用的機制，希望能夠為肺癌的分子診斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 治療與方法

1.1 樣本采集

收集2017年1月—2018年8月于解放軍第960醫(yī)院就診的肺癌患者術(shù)后部分新鮮組織樣本共30例，其中男性18例，女性12例，每例患者均獲得肺癌及相應的癌旁組織樣本，液氮保存?zhèn)溆?，其?例為小細胞肺癌，18例為腺癌，11例為鱗癌。本研究取得了患者及其家屬的同意，并簽署了知情同意書，同時本研究得到了本院醫(yī)學倫理委員會的許可。

1.2 ABL2表達水平的檢測

利用收集到的組織樣本提取RNA，具體操作方法按照TRIzolTMReagent的說明書進行，提取好的RNA一部分直接利用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor進行逆轉(zhuǎn)錄，具體的反應體系和操作按照說明書進行，逆轉(zhuǎn)錄完成后于-20℃保存，另一部分RNA直接凍存于-80℃?zhèn)溆?，避免反復凍融。利用Pubmed查找基因序列，使用Primer軟件設計qRT-PCR的引物，序列如下：ABL2 5′-GTTGAACCCCAGGCACTAAAT-3′；3′-CAACGAAGAGATTAGGGTCACTC-5′，GAPDH5′-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAT-3′；3′-ATGACGAACATGGGGGCATC-5′。利用SYBR?Green Master Mix進行定量檢測。每組實驗做3個復孔，以GAPDH作為內(nèi)參，利用2-ΔΔct的方法進行定量分析。

1.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的建立

人類肺泡基底上皮細胞A549胎中血清由本實驗室提供，培養(yǎng)條件為RPMI1640+10% FBS、37℃和5%CO2。按照說明書用敲減ABL2基因的慢病毒感染A549細胞，感染24 h后換成新鮮的培養(yǎng)基。之后利用G418(4 μg/mL)篩選出穩(wěn)定低表達ABL2的實驗組細胞株和轉(zhuǎn)染無意義干擾序列的對照組細胞株。

1.4 CCK-8法測定細胞增殖

利用細胞計數(shù)板分別對兩組細胞進行計數(shù)，將同樣數(shù)量的細胞鋪到96孔板中培養(yǎng)12 h。檢測時每孔先加入20 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)4 h后用酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光光度值。之后的7天每天都進行同樣的檢測，以空白對照孔為調(diào)零孔繪制細胞的生長曲線。

1.5 細胞劃痕和克隆形成實驗

將兩組處于對數(shù)生長期的細胞接種到6孔板中，細胞密度為5×105個/孔，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，用10 μL的槍頭比著直尺劃痕，PBS清洗3遍，之后加入無血清的培養(yǎng)基放入孵箱中培養(yǎng)，按0、6、12、24、36、48 h在相同位置用光學顯微鏡拍照。

將兩組處于對數(shù)生長期的細胞接種到6孔板中，細胞密度為2×103個/孔，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，中間換液一次，15天后除去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，利用吉姆薩進行染色，Image J軟件進行克隆計數(shù)。

1.6 Western blot實驗

提取兩組細胞的總蛋白，通過BCA試劑盒測量蛋白濃度，加入上樣緩沖液后進行蛋白變性，利用丙烯酰胺凝膠進行蛋白的分離檢測。每孔上樣量為90 μg，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗孵育過夜，二抗室溫1 h，之后利用ECL進行顯色。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ABL2在肺癌和相應癌旁組織中的表達情況

通過Realtime PCR的方法檢測了肺癌和相應癌旁組織樣本中ABL2的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，肺癌組織中ABL2的mRNA水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義(Z=-4.638，P<0.001)(圖1)。

圖1 ABL2在肺癌組織和相應癌旁組織中的表達情況

2.2 穩(wěn)定低表達ABL2細胞株的驗證

建立穩(wěn)定低表達ABL2的實驗組和對照組兩種細胞株，之后通過Western blot檢測ABL2蛋白表達情況，實驗組中ABL2蛋白表達明顯下降(t=21.15，P<0.001)，可以進行后續(xù)的實驗(圖2)。

圖2 A549細胞中沉默ABL2后蛋白表達情況

2.3 沉默ABL2基因?qū)毎鲋澈瓦w移能力的影響

為了驗證沉默ABL2基因?qū)毎鲋澈瓦w移能力的影響，分別進行了細胞增殖、劃痕和克隆形成實驗。與對照組相比較，實驗組從第3天開始活細胞總數(shù)明顯減少(F=7.29，P=0.014)，整體生長速度降低(圖3A)。48 h后實驗組細胞的遷移距離變短(t=18.525，P<0.001)(圖3B)。15天后實驗組細胞株形成的平均克隆數(shù)為76.7個，明顯的少于對照組的212個(t=11.206，P<0.01)(圖3C，圖3D)。

圖3 細胞增殖和遷移能力檢測

2.4 沉默ABL2基因?qū)MT轉(zhuǎn)化的影響

與對照組相比，實驗組上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達升高(t=11.741，P<0.001)，間質(zhì)細胞相關(guān)標志物N-cadherin(t=13.156，P<0.001)、Vimentin(t=5.814，P=0.004)及Snail蛋白(t=15.228，P<0.001)表達降低(圖4)。

2.5 沉默ABL2基因?qū)毎蛲龅挠绊?/h3>

為了檢測沉默ABL2基因?qū)毎蛲龅挠绊?，本研究采用Western blot技術(shù)檢測了BAX和Bcl-XL兩個蛋白的表達水平，與對照組相比，實驗組中Bcl-XL蛋白(t=4.867，P=0.008)表達下調(diào)，BAX蛋白(t=14.558，P<0.001)表達上調(diào)(圖5)。

圖4 EMT相關(guān)蛋白的變化情況

圖5 凋亡相關(guān)蛋白的變化情況

2.6 ABL2通過PI3K/AKT信號通路抑制細胞凋亡

研究表明許多細胞信號通路都可以影響細胞凋亡，在本實驗中主要檢測了PI3K/AKT信號通路主要蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中PI3K P110(t=3.993，P=0.016)、AKT(t=6.626，P=0.003)和p-AKT蛋白(t=3.464，P=0.026)的表達水平都明顯降低(圖6)。

圖6 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的變化情況

3 討論

肺癌是癌癥死亡的最常見原因，非小細胞肺癌占所有肺癌的大約80%。一線的化療、放療和靶向藥物可以對肺癌有較好的治療效果，但是晚期肺癌患者的復發(fā)率極高，患者的5年生存率較低，對于肺癌的徹底治愈也存在著很大的挑戰(zhàn)。在肺癌治療的過程中，許多患者都死于毒副反應。并且隨著治療的進行，腫瘤產(chǎn)生耐藥性，之后的治療效果也變的不明顯。因此開發(fā)一種新的治療方法和治療靶點尤為重要。

ABL2蛋白與c-abl癌基因1蛋白高度相似，后者在正常細胞和腫瘤細胞中均有表達，并參與白血病中ETS基因的易位，其主要是22號染色體bcr和9號染色體長臂上的原癌基因abl重新組合成融合基因?qū)е略擃惣膊〉陌l(fā)生發(fā)展。研究證實ABL2在多種類型的腫瘤中都存在著異常表達[11]，ABL2基因表達的增加和異常擴增都會導致實體瘤中ABL2的激活，從而使ABL2蛋白表達增加。ABL2在肝細胞癌中高表達，與肝細胞癌的不良預后呈正相關(guān)，但是與臨床病理參數(shù)之間沒有顯著的關(guān)系，并可以作為一個獨立的預后因素[12]。ABL2可誘導STAT3的磷酸化并增加MMP1蛋白的活性，有趣的是ABL2和STAT3的作用會促進黑色素瘤細胞的增殖和侵襲，但STATS并不干擾單獨依賴于ABL2的入侵和轉(zhuǎn)移過程[13]。越來越多的研究也證實ABL2在多種實體瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要的作用。但是ABL2在肺癌中并沒有詳細的探究，并且其具體作用機制也不明確。在本研究中，通過對30例肺癌和相應癌旁組織的臨床樣本檢測發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中ABL2的表達水平明顯高于相應的癌旁組織。為了進一步探究ABL2基因的高表達在肺癌中發(fā)揮的作用，在肺腺癌A549細胞系中構(gòu)建了穩(wěn)定低表達ABL2的細胞株。細胞增殖、劃痕和克隆形成實驗證實，與對照組相比，實驗組細胞生長速度減慢，細胞遷移距離變短，形成的克隆數(shù)減少。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT的發(fā)生能夠使癌細胞向周圍組織浸潤，最終導致癌癥的轉(zhuǎn)移。沉默ABL2基因能抑制EMT過程的發(fā)生，其主要變化為E-cadherin表達量上調(diào)，間質(zhì)細胞標志物N-cadherin、Vimentin和Snail表達量降低。PI3K/AKT信號通路參與調(diào)控細胞生長、分化和增殖等過程[14-16]。細胞的凋亡程度受Bcl-2家族、caspase家族、癌基因C-myc和抑制基因p53的調(diào)控[17-18]。在本研究中，我們主要關(guān)注ABL2與肺癌細胞凋亡之間的關(guān)系。結(jié)果證實，沉默ABL2基因能夠下調(diào)Bcl-XL蛋白表達，上調(diào)BAX蛋白表達，同時還會抑制PI3K P110、AKT和p-AKT蛋白的表達，從而促進細胞凋亡的發(fā)生。

本研究通過探究ABL2在肺癌中的作用及機制，希望能夠為肺癌的臨床診斷提供新的思路和解決方案，進一步為臨床上肺癌的分子靶向治療提供一個新的分子靶標，為肺癌的早期診斷和治療提供廣泛的應用基礎。