詹 琦 周 晟 婁麗萍

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是一種相對罕見的惡性腫瘤，起源于肝內(nèi)、肺門周圍和遠端膽管樹的上皮細胞，是一種致命性的癌癥。在過去的30年中，CCA的發(fā)病率和死亡率逐年增加，5年生存率較低[1]。診斷方面，膽管炎發(fā)作、膽道梗阻、肝內(nèi)膽管結(jié)石造成膽管壁的炎癥變化很難在病理上同癌變相鑒別且CCA缺乏特異性的腫瘤標志物，致使患者被確診為CCA時多已進展至晚期[2]。目前，70%～80%的CCA患者均無法接受手術(shù)治療，而只能采取放化療的保守治療方法，然而保守治療并不能有效改善CCA患者的生存率[2]。因此，研究人員期望能夠找到一種提高晚期CCA患者總生存期和預(yù)后的有效方法。有文獻表明[3-10]，在CCA潛在的分子治療靶標中，表皮生長因子受體(EGFR)、表皮生長因子受體2(HER2)和表皮生長因子受體3(HER3)存在明顯的表達異常。然而，CCA患者中EGFR、HER2和HER3的表達情況與其臨床病理特征的關(guān)系，以及EGFR、HER2和HER3的表達情況對總生存期和CCA細胞增殖的影響目前研究還比較少。為了觀察EGFR、HER2和HER3的生物學(xué)行為，并研究這些分子是否能夠作為分子治療靶標，本文對50例CCA患者癌組織中的EGFR、HER2和HER3的表達情況進行觀察并對以上分子與CCA患者臨床病理特征之間的關(guān)系及其表達對CCA患者總生存期和對CCA細胞增殖的影響進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2009年1月—2013年10月我院手術(shù)切除癌的50例CCA患者進行研究，其中肝內(nèi)CCA 28例，肝外CCA 22例。所有患者術(shù)后制作病理石蠟標本，標本經(jīng)常規(guī)HE染色后由至少2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師診斷為CCA，且術(shù)前均未進行放療或化療。其中男35例，女15例，年齡40～75歲。病理組織分級：高分化9例，中分化11例，低分化30例。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者14例。同時取所有患者新鮮的癌組織和癌旁正常組織，立即投入液氮中保存，用于提取組織mRNA，其余組織送常規(guī)病檢，中性甲醛固定，石蠟包埋。

通過電話隨訪了解患者的生存情況，隨訪時間從術(shù)后第2～34個月，中位隨訪時間為22個月。總生存時間(Overall survival，OS)是從手術(shù)日期到隨訪截止日期，或由于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 CCA細胞株 CCA細胞株QBC939購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化實驗 標本經(jīng)常規(guī)HE染色和EGFR、HER2、HER3免疫組織化學(xué)染色?？乖迯?fù)采用高壓修復(fù)法，免疫組化SP法檢測則參照試劑說明書。

1.2.2 RT-PCR實驗引物 EGFR：上游5′-TTGTTGCAGATCGTGGACAT-3′，下游5′-ACATAACCAGCCACCTCCTG-3′；HER2：上游5′-CATGTCATCGTCCTCCAGCAG-3′，下游5′-TTGACTCTGAATGTCGGCCAA-3′；HER3：上游5′-GGACUCGAGCAACAUUGAUTT-3′。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 40 s(40個循環(huán))，72℃ 10 min。在DNA擴增儀上擴增相應(yīng)的靶基因片段，同時擴增GAPDH片段作為內(nèi)參照。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 細胞長至70%融合時可用于轉(zhuǎn)染。嚴格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進行操作，轉(zhuǎn)染36 h后可用于功能實驗。

1.2.4 Western blot 等量提取細胞蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA的TBST室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育。第二天用0.1% TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進行顯色。Actin作為內(nèi)參對照。所有實驗至少重復(fù)3次。

1.2.5 MTT方法檢測細胞增殖能力 上述細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μL的MTT溶液，作用4h后吸出上清，加入150 μL的DMSO溶液，低速震蕩10 min后，波長490 nm 處測定OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，EGFR、HER2和HER3的表達與CCA患者各臨床病理特征之間的關(guān)系比較采用χ2檢驗、連續(xù)性校正χ2檢驗或Fisher確切概率法；RT-PCR和MTT結(jié)果采用方差分析和t檢驗，siRNA敲低EGFR、HER2和HER3對CCA細胞增殖的影響采用EGFR、HER2和HER3分別與對照組進行t檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，并進行Log-rank檢驗。Cox比例風險模型進行多因素分析，分析影響CCA患者總生存期的因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的表達情況

在CCA組織中可檢測EGFR、HER2和HER3的表達，EGFR主要在癌細胞胞質(zhì)和胞膜中表達，HER2陽性顯示為癌細胞胞膜上連續(xù)棕黃色染色，而HER3主要在胞質(zhì)中出現(xiàn)陽性染色。圖1A-C所示為EGFR、HER2和HER3在CCA組織中陽性染色。50例CCA組織中EGFR、HER2和HER3表達陽性的分別為13(26.0%)、7(14.0%)和31(62.0%)。而在癌旁組織中未檢測到EGFR、HER2和HER3的表達(圖1D-F)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2 EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的表達情況

EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的mRNA表達水平均顯著高于癌旁組織(P<0.001)(圖2)。

圖2 RT-PCR方法檢測EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的表達

2.3 EGFR、HER2和HER3表達與CCA臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

HER2的表達與患者性別、年齡、癌分化程度和臨床分期無關(guān)(P>0.05)，EGFR和HER3表達與患者性別、年齡和臨床分期無關(guān)，與CCA的分化程度有關(guān)(P<0.05)，EGFR、HER2和HER3表達在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達率明顯高于無轉(zhuǎn)移組(P<0.05)(表1)。

表1 EGFR、HER2和HER3表達與CCA臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4 EGFR、HER2和HER3與CCA術(shù)后總生存期之間的關(guān)系

EGFR、HER2和HER3陽性者術(shù)后總生存期明顯低于EGFR、HER2和HER3陰性者(P<0.05)(表2，圖3)。

表2 CCA患者總生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

圖3 不同EGFR、HER2和HER3表達CCA患者Kaplan-Meier生存曲線

2.5 siRNA敲低EGFR、HER2和HER3對CCA細胞增殖的影響

敲低CCA細胞株QBC939中EGFR、HER2和HER3表達后(圖4A)，QBC939細胞增殖能力的OD值均顯著下降，對照細胞OD值為(1.52±0.21)，EGFR siRNA處理后OD值降為(0.39±0.18)(P=0.003)，HER2 siRNA處理后OD值降為(0.56±0.14)(P=0.024)，HER3 siRNA處理后OD值降為(0.42±0.20)(P=0.011)(圖4B)。

圖4 siRNA敲低EGFR、HER2和HER3對CCA細胞增殖的影響

3 討論

表皮生長因子受體(HER)家族成員包括HER1(EGFR/ErbB1)、HER2(NEU/ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)四種類型。這些膜受體均由細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有保守酪氨酸激酶(TK)結(jié)構(gòu)域的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。ErbB家族受體參與各種病理生理功能，包括細胞增殖、分化、生存、黏附和遷移等[1]。

表皮生長因子受體EGFR，即HER1，廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)細胞等細胞表面，生理條件下的EGFR信號通路激活對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，當EGFR與表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)或轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor，TGF)結(jié)合以后，可以啟動EGFR下游的信號傳導(dǎo)通路，促進癌細胞的增殖與遷移。EGFR下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前已研究的較為清楚，主要通過RAS/RAF/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3K/PDK/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將外界信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi)[11-13]。EGFR在多種癌內(nèi)存在異常表達和基因突變，如乳腺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等[14-17]，EGFR在這些癌組織中的異常表達與患者的預(yù)后和總生存期密切相關(guān)。

HER2同EGFR均屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族。HER2過表達可導(dǎo)致受體二聚化(自體或異體的)。受體二聚化后，ErbBs胞漿段出現(xiàn)自體磷酸化，進而向下游傳遞信號活化ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]。同時，HER2還可阻斷EGFR的內(nèi)化降解，致使EGFR表達水平升高[19]。因此，HER2過表達可使下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度激活，從而促進癌的發(fā)生發(fā)展。

與其他幾種ErbB受體不同的是，HER3不能形成同源二聚體且胞內(nèi)的TK結(jié)構(gòu)域是非活化的，故其催化活性較低。這是由于HER3缺少關(guān)鍵殘基，因而不能催化激活其他激酶，通常被認為是其他HER家族成員的信號傳導(dǎo)底物。雖然HER3的酪氨酸激酶活性比較弱，但亦可與EGFR家族中的其他成員(尤其是與EGFR和HER2)形成異源二聚體，從而導(dǎo)致HER3羧基末端酪氨酸殘基的磷酸化，進而激活RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT的信號傳導(dǎo)通路，目前已有研究證實在乳腺癌中HER3能夠通過與HER2形成異源二聚體來促進HER2陽性乳腺癌細胞增殖[10]。

膽管上皮細胞排列在肝內(nèi)和肝外膽管中，主要作用是分泌和運輸膽汁。在CCA組織中，EGFR、HER2存在著明顯的異常表達。其中，免疫組化檢測EGFR蛋白的表達率為26%，且與患者不良預(yù)后相關(guān)；HER2的表達量與腫瘤部位相關(guān)[3-10]。然而，目前在CCA中HER3的表達情況研究較少，CCA中EGFR、HER2和HER3的表達情況與其患者的臨床病理特征的關(guān)系，以及EGFR、HER2和HER3的表達情況對CCA患者總生存期和對CCA細胞增殖影響的相關(guān)研究較罕見。本研究通過免疫組化檢測了50例CCA患者癌組織中EGFR、HER2和HER3的表達情況，分析了上述分子表達與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。在細胞水平上，在CCA QBC939細胞系驗證了EGFR、HER2和HER3的表達對CCA細胞增殖的影響。本研究顯示，CCA腫瘤組織中的EGFR、HER2和HER3蛋白表達和mRNA表達水平相較于癌旁組織均顯著升高，說明CCA組織中存在以上分子的過表達；HER2的蛋白表達水平僅僅與CCA是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；而EGFR和HER3不僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，還與癌組織的分化程度相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示EGFR、HER2和HER3表達陽性的患者總生存期明顯低于陰性表達患者。進一步的實驗顯示，當敲低細胞株QBC939中EGFR、HER2和HER3表達后，QBC939細胞增殖能力顯著降低。

綜上所述，本研究結(jié)果提示CCA組織中上調(diào)表達的EGFR、HER2和HER3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EGFR、HER2和HER3參與CCA惡化的機制可能是通過促進CCA細胞增殖相關(guān)。然而，關(guān)于EGFR、HER2和HER3在CCA細胞凋亡和浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制還需進一步的深入研究。