朱志超 白 煜 盧緒章 孫 曉 何流漾 戚春建

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一種危及患者生命的血液系統(tǒng)惡性增殖性疾病[1]，其發(fā)病率隨著年齡的增長而逐漸增加?，F(xiàn)有治療措施并不能完全治愈AML，因此尋找更有效的抗白血病藥物或治療手段成為AML治療的當(dāng)務(wù)之急。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一種DNA修復(fù)酶，在DNA修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用，抑制PARP活性則能阻止腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)從而抑制腫瘤生長。目前PAPR抑制劑在臨床上已用于卵巢癌和乳腺癌的治療，并取得了良好的治療效果。研究也證實(shí)，白血病細(xì)胞中PARP-1活性要高于非腫瘤細(xì)胞[2]；而在臨床可達(dá)到濃度條件下，PARP抑制劑olaparib能夠抑制體外原發(fā)性AML母細(xì)胞的增殖[3]，顯示PARP抑制劑可成為AML治療的潛在藥物。因此，本文擬選用PARP抑制劑olaparib，以AML細(xì)胞株HL-60細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察PARP抑制劑olaparib對(duì)HL-60細(xì)胞的體外抑制作用，并初步探索olaparib的作用機(jī)制，以期為olaparib的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

AML細(xì)胞株HL-60購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Olaparib購自Selleck公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；培養(yǎng)基(RPMI1640)購自美國Gibico公司；β-actin單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；PARP-1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)的單克隆抗體購自Santa cruze公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105/mL，同時(shí)加入olaparib，加藥濃度分別為1.25、2.5、5、10 μmol/L，以100 μL/孔接種于96孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、120 h和168 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后于450 nm處測量吸光度值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置試劑空白孔(僅含培養(yǎng)基與藥物)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔(加藥濃度為0組細(xì)胞，即對(duì)照組)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

細(xì)胞存活率(%)=(加藥孔A450值-試劑空白孔A450值)/(實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔A450值-試劑空白孔A450值)×100%

1.3 Annexin-V/PI雙標(biāo)記法分析細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，olaparib加藥終濃度分別為0、2.5、5、10 μmol/L，2 mL/孔接種至6孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h和78 h后進(jìn)行檢測。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，以100 μL 1×Annexin-V binding buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，之后加入5 μL Annexin-V和1 μL碘化丙啶(Propidium lodide，PI)工作液。室溫避光孵育15 min后，每管加入400 μL 1×Annexin-V binding buffer，混勻后上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6.1軟件分析。

1.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

收集經(jīng)不同濃度(0、2.5、5、10 μmol/L)olaparib處理48 h的HL-60細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg總蛋白以10% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，80 mV恒壓電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 mV至電泳結(jié)束。200 mA恒流條件下，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，再以5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗滌之后，分別與PARP-1、Caspase-3、β-actin等蛋白單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4℃冰箱孵育過夜，洗脫多余抗體之后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗作用后曝光顯色，Quantity One軟件掃描灰度定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Olaparib對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK-8結(jié)果顯示，當(dāng)olaparib處理48 h后，HL-60細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制，并且隨著藥物作用濃度的增加，HL-60細(xì)胞各組增殖活性不斷降低。在不同濃度(1.25、2.5、5、10 μmol/L)olaparib作用72 h、120 h和168 h下，HL-60細(xì)胞增殖活性顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 Olaparib對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2 Olaparib誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡作用研究

此外，olaparib對(duì)HL-60細(xì)胞活性的增殖抑制作用與藥物作用時(shí)間也密切相關(guān)。隨著藥物作用時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖抑制率不斷增加。其中以10 μmol/L濃度為例，olaparib處理48 h后，HL-60細(xì)胞增殖活性為(83.8±2.05)%；當(dāng)olaparib處理168 h后，HL-60細(xì)胞增殖活性僅為(47.03±1.4)%，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

2.2 Olaparib可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡

根據(jù)增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇0、2.5、5、10 μmol/L 4個(gè)濃度作進(jìn)一步研究。不同濃度olaparib(0、2.5、5、10 μmol/L)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管olaparib在早期(24 h)并不能誘導(dǎo)HL-60出現(xiàn)明顯凋亡，但當(dāng)藥物作用時(shí)間延長至48 h或72 h時(shí)，HL-60細(xì)胞凋亡比例逐漸增加(圖2A)，顯示olaparib能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡。具體結(jié)果如下，當(dāng)olaparib作用24 h時(shí)，各組(0、2.5、5、10 μmol/L)誘導(dǎo)凋亡比例分別為(4.66±0.37)%、(5.15±0.82)%、(6.64±1.49)%和(6.38±0.99)%；olaparib作用48 h時(shí)，HL-60細(xì)胞凋亡比例分別為(4.73±0.06)%、(7.7±0.56)%、(9.71±0.42)%和(13.65±1.3)%；olaparib作用時(shí)間延長至72 h時(shí)，各組凋亡比例分別為(5.24±0.71)%、(18.71±2.48)%、(27.86±4.53)%和(42.57±4.23)%(圖2B)。通過比較不同濃度(0、2.5、5、10 μmol/L)olaparib處理48 h、72 h的HL-60細(xì)胞的凋亡率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5、10 μmol/L olaparib組與對(duì)照組相比，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示olaparib對(duì)HL-60的誘導(dǎo)凋亡作用具有劑量依賴效應(yīng)。

2.3 Olaparib誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制研究

本研究首先檢測了經(jīng)不同濃度olaparib處理的HL-60細(xì)胞內(nèi)PARP-1蛋白表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)olaparib處理后的HL-60細(xì)胞，PARP-1的活性受到抑制，cleaved-PARP表達(dá)增加(圖3)。凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，olaparib處理48 h的HL-60細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，因此本研究同時(shí)檢測了凋亡標(biāo)志蛋白分子Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pro-caspase-3在olaparib的作用下形成有活性的蛋白亞基，說明活化的Caspase-3促使HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖3)。

圖3 Olaparib的抗HL-60作用機(jī)制研究

3 討論

PARP抑制劑是一種靶向PARP的癌癥療法，其設(shè)計(jì)之初僅僅是作為削弱腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力以增強(qiáng)放化療作用的輔助療法，因此直到BRCA突變基因攜帶者對(duì)PARP抑制劑的高度敏感性的發(fā)現(xiàn)，才使得PARP抑制劑成為首個(gè)成功利用合成致死(Synthetic lethality)概念獲得FDA批準(zhǔn)的抗癌藥物。

Olaparib作為一種耐受性較好的口服PARP抑制劑，目前在臨床主要用于治療攜帶BRCA基因突變的卵巢癌和乳腺癌患者。而PARP抑制劑對(duì)于其他腫瘤的治療目前仍處于研究階段，其中就包括AML。值得注意的是，盡管PARP抑制劑通常與BRCA1/2基因突變聯(lián)系在一起，但PARP抑制劑對(duì)于許多沒有BRCA基因突變的腫瘤也具有抑制作用，其原因可能是其他因素導(dǎo)致的同源重組修復(fù)(Homologous recombination repair，HRR)缺陷使得這些腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑敏感。比如，在AML細(xì)胞中雖然BRCA1/2的表達(dá)普遍較低[4]，但某些AML相關(guān)基因的重排，包括AML1-ETO和PML-RARα融合，都被證實(shí)由于同源重組缺陷而被賦予PARP抑制劑敏感性[5]。研究也發(fā)現(xiàn)，與非致瘤性細(xì)胞相比較，白血病細(xì)胞中的PARP-1的活性是增加的[2]，使用PARP抑制劑olaparib可優(yōu)先殺死白血病細(xì)胞并保留正常的淋巴細(xì)胞，并且對(duì)健康供體獲得的骨髓或CD34+細(xì)胞富集的外周血的生存能力影響較小[6]。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向單核細(xì)胞和粒細(xì)胞系分化的能力[5]。這些證據(jù)都顯示PARP抑制劑可作為AML治療的潛在藥物，但是其內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

因此，本研究中不僅觀察了olaparib單藥對(duì)人AML細(xì)胞株HL-60的抑制作用，也研究了olaparib在HL-60細(xì)胞中的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)olaparib單藥不僅對(duì)HL-60細(xì)胞具有明顯的體外增殖抑制作用，也可通過活化Caspase-3，抑制PARP-1活性，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡。

近期有報(bào)道指出，olaparib可通過上調(diào)死亡受體，如FAS和DR5，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)死亡受體的敏感性[7]。本研究則發(fā)現(xiàn)olaparib可誘導(dǎo)Caspase-3活化促進(jìn)HL-60凋亡。眾所周知，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其最主要的底物正是PARP。而在PARP的17個(gè)家族成員中，只有PARP-1、PARP-2和PARP-3參與受損DNA的修復(fù)[8]。其中PARP-1作為DNA損傷感應(yīng)器和信號(hào)傳導(dǎo)在DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡、增殖分化等方面發(fā)揮著重要的作用[9]，抑制PARP-1活性則能阻礙PARP-1介導(dǎo)的DNA修復(fù)機(jī)制[9]。研究顯示，當(dāng)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)后，Caspase-3和Caspase-7通過識(shí)別PARP-1核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NSL)的DEVD模序，促使PARP內(nèi)與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端催化區(qū)域分離，導(dǎo)致PARP-1分裂成p89和p24兩個(gè)片段，后者與DNA缺口不可逆地結(jié)合抑制了PARP-1與DNA缺口的結(jié)合能力，導(dǎo)致PARP-1損傷修復(fù)作用消失，從而使受其負(fù)調(diào)控的裂解核小體間DNA的核酸內(nèi)切酶活性增高，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究中olaparib處理后的HL-60細(xì)胞cleaved PARP-1表達(dá)水平增加，顯示PARP-1活性受到抑制。因此，本研究認(rèn)為olaparib也可通過抑制HL-60細(xì)胞內(nèi)PARP-1的活性發(fā)揮抗白血病作用。

以往研究顯示AML細(xì)胞中BRCA1/2低表達(dá)，使得olaparib對(duì)AML細(xì)胞的增殖抑制作用只能部分依賴合成致死作用，更多的可能與olaparib對(duì)AML細(xì)胞的細(xì)胞毒性有關(guān)[7]。本研究結(jié)果則進(jìn)一步說明olaparib對(duì)AML細(xì)胞的細(xì)胞毒性除已證實(shí)的合成致死和聚二磷酸腺苷核糖基化(Poly-ADP-ribosylation，PARPylation)阻滯外[4]，也依賴于olaparib對(duì)其他功能的抑制作用。綜合以上，本研究認(rèn)為olaparib不僅通過抑制HL-60細(xì)胞內(nèi)PARP-1的活性發(fā)揮抗白血病作用，更可誘導(dǎo)Caspase-3活化，進(jìn)一步抑制PARP-1的活性，最終促使HL-60細(xì)胞凋亡作用的發(fā)生。

綜上所述，近年來有很多PARP-1抑制劑與多種傳統(tǒng)化療藥物(如阿霉素[11]、地西他濱[12]等)聯(lián)合使用的研究報(bào)道，這些研究都指向PARP抑制劑可增強(qiáng)AML細(xì)胞DNA損傷[13]，表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。結(jié)合本研究，我們認(rèn)為olaparib不僅可作為化療協(xié)同用藥，同時(shí)也可作為單藥發(fā)揮直接抗白血病的作用，是未來臨床AML治療的潛在藥物。