王 宏，沈宇燕，袁 玲，劉琳娜，李 旭，崔曉雪，張發(fā)昌，王 蕾

（1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2.天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300385；3.中山市中醫(yī)院，中山 528400）

天津同仁堂冠脈通片是治療冠心病的中成藥，由補(bǔ)腎與活血開竅方藥構(gòu)成，淫羊藿、桑寄生溫補(bǔ)腎陽(yáng)，枸杞子、何首烏滋補(bǔ)肝腎，紅花活血通經(jīng)，丹參活血祛瘀，石菖蒲、冰片醒神開竅，共奏補(bǔ)腎活血之功，用于肝腎不足、痰瘀阻絡(luò)之胸痹。然而以往研究?jī)H局限在對(duì)心肌和冠狀動(dòng)脈的改善作用觀察[1-2]，進(jìn)一步挖掘冠脈通片“補(bǔ)腎活血”中醫(yī)治則對(duì)明確其臨床定位具有重要意義。

血管鈣化是慢性腎病（CKD）患者嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致CKD 患者心血管疾病發(fā)病率和病死率明顯升高的重要原因[3]。CKD 血管鈣化屬于異位鈣化，是由腎臟損及心血管的病理變化[4]，對(duì)應(yīng)中醫(yī)“腎虛血瘀”證候[5-6]，與冠脈通片補(bǔ)腎活血法的證治范圍非常符合。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CKD 血管鈣化大鼠模型，觀察冠脈通片對(duì)CKD 血管鈣化的防治作用，為突顯冠脈通片“補(bǔ)腎活血”的證治特色提供有力的研究手段。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006]。5 只/籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，室溫（23±2）℃、相對(duì)濕度40%～70%，自由飲水，飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0010]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 冠脈通片：0.3 g/片，由天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司提供（批號(hào)HP06001）；維生素D滴劑（VD3，膠囊型）：400 U/粒，由國(guó)藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司生產(chǎn)（批號(hào)12973038）；維生素B4片：10 mg/片，由天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)（批號(hào)1608008）。

1.3 試劑及儀器 磷酸二氫鈉（批號(hào)2017 年7 月5 日）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，總蛋白定量測(cè)試盒[二喹啉甲酸（BCA）法，貨號(hào)A045-3]、鈣試劑盒（貨號(hào)C004-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

日立7080 全自動(dòng)生化儀（日本積水醫(yī)療科技有限公司），XHF-1 高速分散器（上海金達(dá)生化儀器廠]，PL203 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，LDZ5-2 低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），Infinite M200 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司），ASP200S 自動(dòng)真空組織脫水機(jī)、EG1150H 自動(dòng)生物組織包埋機(jī)、RM2255 切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），Ci-L 顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 將雄性SD 大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、VD3組（10 μL/只，相當(dāng)于人用劑量的6 倍）、冠脈通片0.46、0.23 g/kg 組（相當(dāng)于人用劑量的6、3 倍），每組12 只（2 只備用）。造模當(dāng)天開始給藥，給藥體積10 mL/kg，每日1 次，連續(xù)10 周。

2.2 CKD 血管鈣化模型的建立 除正常組外，其余4 組灌胃給予腺嘌呤200 mg/kg 加高磷飲水制備CKD 血管鈣化模型。分組當(dāng)天開始灌胃給予腺嘌呤溶液，給藥體積10 mL/kg，每日1 次，連續(xù)10 周。正常組以等量純凈水對(duì)照處理。除正常組給予普通飲水外，其余4 組均給予高磷飲水（0.5 g/只，2.5 g 溶入500 mL 飲用水中），每籠每日1 瓶，連續(xù)10 周。以硝酸銀染色觀察到血管鈣化灶作為模型成立的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 血清生化指標(biāo) 大鼠腹主動(dòng)脈取血，冰上靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min 取血清，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清尿素、肌酐、鈣和磷的水平。

2.3.2 血管鈣含量測(cè)定 剖取大鼠腹主動(dòng)脈，生理鹽水洗去血液，剔凈脂肪。準(zhǔn)確稱取動(dòng)脈組織（0.050±0.001）g，加入9 倍體積生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿。2 500 r/min 離心10 min 取上清液，得10%組織勻漿。取20 μL 10%組織勻漿再用生理鹽水按1∶9 稀釋成1%組織勻漿，按總蛋白定量測(cè)試盒測(cè)總蛋白濃度；另取60 μL 10%組織勻漿按鈣測(cè)試盒說(shuō)明書測(cè)定鈣含量。

表1 冠脈通片對(duì)大鼠血清尿素、肌酐、鈣和磷水平的影響（x±s）Tab.1 Effects of Guanmaitong Tablets on serum urea，creatinine，calcium and phosphorus levels in rats（x±s）

2.3.3 腎臟和血管組織學(xué)病理檢測(cè) 剖取大鼠腎臟和胸主動(dòng)脈，生理鹽水洗去血液，10%中性甲醛固定。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腎臟和血管組織的病理改變情況。

2.3.4 硝酸銀染色觀察血管鈣化 剖取大鼠胸主動(dòng)脈，生理鹽水洗去血液，10%中性甲醛固定。硝酸銀染色觀察血管鈣化灶。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 冠脈通片對(duì)大鼠血清尿素、肌酐、鈣和磷水平的影響 表1 顯示，與正常組大鼠相比，模型組大鼠血清尿素、肌酐及磷水平明顯升高（P＜0.01），鈣水平明顯降低（P＜0.01）。灌胃給藥10 周后，冠脈通片0.46、0.23g/kg 組能顯著降低模型大鼠血清尿素、肌酐及磷的含量（P＜0.01 或P＜0.05），升高鈣含量（P＜0.05），與VD3組比較，冠脈通片高、低劑量組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 冠脈通片對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈鈣含量的影響 表2顯示，與正常組比較，模型組大鼠腹主動(dòng)脈鈣含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，冠脈通片0.46、0.23 g/kg 組腹主動(dòng)脈鈣含量顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）；與VD3組比較，冠脈通片高、低劑量組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.3 冠脈通片對(duì)大鼠腎組織病理學(xué)的影響 正常組大鼠腎小球數(shù)目正常，未見(jiàn)纖維化及新月體等病變，腎小管上皮完好，未見(jiàn)變性、壞死及管型，腎間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。模型組腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管擴(kuò)張，局部見(jiàn)棕褐色結(jié)晶沉積，腎臟間質(zhì)彌漫淋巴和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，大量成纖維細(xì)胞增生，形成廣泛纖維化，腎臟血管明顯減少。冠脈通片較模型組正常腎小球數(shù)目增多，腎小管擴(kuò)張程度降低，炎性細(xì)胞數(shù)量下降，腺嘌呤結(jié)晶減少。其中，冠脈通片0.46 g/kg 組效果更好。

表2 冠脈通片對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈鈣含量的影響（x±s）Tab.2 Effect of Guanmaitong Tablets on calcium content in rats abdominal aorta（x±s） μmol/gprot

3.4 冠脈通片對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管鈣化的影響 圖2顯示，正常組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜完整、中膜無(wú)異常；CKD 血管鈣化模型大鼠是鈣化異位到胸主動(dòng)脈，中膜可見(jiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)且呈連續(xù)線性分布，硝酸銀染色后可見(jiàn)黑色鈣化灶呈連續(xù)性分布于胸主動(dòng)脈。冠脈通片0.46、0.23 g/kg 組大鼠胸主動(dòng)脈鈣化灶面積縮小，其中冠脈通片0.46 g/kg 組效果更好。

圖1 冠脈通片對(duì)大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響（HE，×200）Fig.1 Effect of Guanmaitong tablets on renal histopathology in rats（HE，×200）

圖2 冠脈通片對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管鈣化的影響（×100）Fig.2 Effect of Guanmaitong tablets on thoracic aorta calcification in rats（×100）

4 討論

CKD 血管鈣化由礦物質(zhì)骨代謝異常引起，屬于CKD 礦物質(zhì)及骨代謝紊亂（CKD-MBD）的范疇[7]。運(yùn)用中醫(yī)病機(jī)分析，血管鈣化歸為“腎虛血瘀”范疇[8]。精血同源，元?dú)飧谀I，久病入絡(luò)是腎虛血瘀形成的重要基礎(chǔ)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》“骨萎”“骨枯”“骨痹”的記載，對(duì)應(yīng)CKD-MBD 的病理狀態(tài)，清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》闡述了因虛致瘀的實(shí)質(zhì)[9]。上述理論為冠脈通片補(bǔ)腎活血法防治CKD 血管鈣化奠定了理論基礎(chǔ)。本課題組前期研究證實(shí)冠脈通片兼具補(bǔ)腎和活血雙重作用，能明顯改善腎陽(yáng)虛大鼠的腎功能[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃給予腺嘌呤加高磷飲水的方法構(gòu)建CKD 血管鈣化大鼠模型。腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變成極難溶解于水的2，8-二羥基腺嘌呤，后者機(jī)械性阻塞腎小管，導(dǎo)致腎功能障礙[12]。高血磷是CKD 患者發(fā)生血管鈣化的直接危險(xiǎn)因素。升高的血清磷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多方面促進(jìn)血管鈣化[13]。模型組大鼠腎功能異常，腎臟組織病變明顯，鈣、磷代謝紊亂，胸主動(dòng)脈鈣化明顯，說(shuō)明CKD 血管鈣化模型復(fù)制成功。

維生素D3（VD3）在血管鈣化的防治中發(fā)揮重要作用[14]。VD3缺乏導(dǎo)致鈣、磷代謝紊亂及高甲狀旁腺素水平，進(jìn)而引發(fā)血管鈣化。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置VD3為陽(yáng)性對(duì)照藥。CKD 時(shí)，腎1α-羥化酶分泌減少，VD3合成受損，損害腸道鈣吸收，導(dǎo)致低鈣血癥和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)。甲狀旁腺激素升高降低尿鈣排泄，增加尿磷酸鹽排泄，增加鈣的骨吸收[15]。因此，CKD 血管鈣化大鼠模型血清鈣水平降低而血管中鈣含量增加。

冠脈通片能明顯降低模型大鼠血清尿素和肌酐水平，改善腎組織病變程度，提示冠脈通片對(duì)CKD具有防治作用，體現(xiàn)了其補(bǔ)腎方藥的作用；此外，冠脈通片能夠糾正模型大鼠鈣、磷代謝紊亂狀態(tài)，降低腹主動(dòng)脈鈣含量，縮小胸主動(dòng)脈鈣化面積，提示冠脈通片對(duì)血管鈣化的防治作用，體現(xiàn)了其活血開竅的作用。CKD 血管鈣化屬于異位鈣化，病理變化由腎及心。因此，冠脈通片雖然對(duì)血管鈣化有直接的治療作用，但有可能更側(cè)重于通過(guò)CKD 的治療發(fā)揮對(duì)血管鈣化的防治作用。

冠脈通片對(duì)CKD 血管鈣化有明顯防治作用，突顯了其“補(bǔ)腎活血”的證治特色，為擴(kuò)大其臨床適應(yīng)癥提供了有力的數(shù)據(jù)支持。