李松翰， 羅 穎， 李朝暉， 顏決涌， 朱娉逸， 岑 威， 朱曉陽， 王銳東， 孫雙一， 林刻智

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 浙江 溫州 325000)

胃癌是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，中國作為胃癌發(fā)病的高危區(qū)域之一，我國每年新發(fā)病例在全球所占比例可達(dá)42%[1-2]。除腫瘤微環(huán)境與遺傳易感因素外，幽門螺旋桿菌感染、基因調(diào)控及氧化應(yīng)激等因素可能影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。研究表明，需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE-1α)-X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP-1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最重要的通路之一，與腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)[5-6]。

XBP-1是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。通常情況下，轉(zhuǎn)錄因子可以與信號通路共同作用，參與調(diào)控胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞分裂和分化。 XBP-1有2種剪切形式，即未剪切(XBP-1U)和已剪切(XBP-1S)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下，IRE1α激活XBP-1U轉(zhuǎn)變?yōu)閄BP-1S，這種動態(tài)平衡轉(zhuǎn)變過程，將會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或增殖[7]。相關(guān)研究指出，XBP-1的表達(dá)與急性髓系白血病、乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8-9]，而在胃癌組織中XBP-1的表達(dá)水平及臨床意義未見報道。我們前期采用胃癌基因芯片分析的方法，發(fā)現(xiàn)XBP-1基因在胃癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織呈下調(diào)趨勢，通過GEO數(shù)據(jù)庫比對XBP-1基因在胃癌組織中表達(dá)與芯片檢測結(jié)果一致。為進(jìn)一步探究XBP-1在胃癌組織中的表達(dá)情況，本研究通過免疫組化、real-time PCR和Western blot等技術(shù)，結(jié)合臨床病理數(shù)據(jù)以及患者生存期分析，明確XBP-1在胃癌組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并分析其臨床意義。

材 料 和 方 法

1 材料

TRIzol試劑購自Invitrogen；ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Master Mix 熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo；Gelred染料購自Biotium；配膠試劑盒購自上海碧云天生物公司；兔抗人XBP-1蛋白單克隆Ⅰ抗購自Abcam；HRP標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗、羊血清和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；引物由華大基因科技股份有限公司合成。

2 方法

2.1組織標(biāo)本采集及處理 本研究涉及的48對胃癌標(biāo)本均取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2014～2015年期間接受手術(shù)的胃癌術(shù)后患者。胃癌的病理學(xué)診斷由醫(yī)院病理科術(shù)后根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)確診。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療，且在術(shù)后根據(jù) NCCN臨床實(shí)踐指南：胃癌(2014.v1)接受嚴(yán)格化療。胃癌組織及相對應(yīng)癌旁組織(取自距癌灶2 cm處)的配對標(biāo)本被分為2部分：一部分標(biāo)本在手術(shù)切除后30 min內(nèi)直接液氮凍存，以備RNA、蛋白的提??；另一部分標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

2.2免疫組化觀察 5 μm 的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇至水、經(jīng)微波修復(fù)，室溫冷卻， 3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS清洗，羊血清封閉1 h后。甩去血清，直接滴加XBP-1特異性抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，室溫下復(fù)溫1 h。參照說明書，滴加羊抗兔II抗，37 ℃孵育30 min。PBS清洗，甩干。DAB顯色。蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、流水藍(lán)化、中性樹膠封片。以Image-Pro Plus 6.0生物醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)，測量XBP-1蛋白的表達(dá)量。

2.3Real-time PCR實(shí)驗(yàn) cDNA第1鏈由提取自組織的RNA參照ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄而來。反應(yīng)結(jié)束后置于-20 ℃保存。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR。相關(guān)引物序列信息見表1。反應(yīng)體系包括：2 μL反逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2 μL轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2×SYBR Green I Master Mix，6 pmol上游引物，6 pmol下游引物。程序設(shè)定為:95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、62 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循環(huán)40次(StepOne Plus Real-Time PCR system)。所有樣品均嚴(yán)格按照3個復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標(biāo)本中XBP-1相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=(腫瘤CtXBP-1-腫瘤CtGAPDH)-(癌旁CtXBP-1-癌旁CtGAPDH)。在1×TAE緩沖液環(huán)境中，以瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行跑膠顯影以進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。

表1 引物序列

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 利用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取胃癌組織和癌旁組織蛋白，每個點(diǎn)樣孔中加入50細(xì)胞蛋白，90 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)條帶遷移至底部。100 V、低溫轉(zhuǎn)膜45 min, 使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶2 000稀釋比例的I抗4 ℃封閉過夜, 加入1∶5 000濃度的II抗室溫反應(yīng)2 h，DAB法進(jìn)行顯色反應(yīng)，利用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，目的條帶與內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示XBP-1的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所涉及的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，對免疫組化、real-time PCR及Western blot結(jié)果與各臨床病理因素的相關(guān)性進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、配對樣本t檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier法對XBP-1高表達(dá)組與低表達(dá)組生存分析進(jìn)行3年生存率分析，組間差異比較用log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胃癌組織中XBP-1 mRNA的表達(dá)下調(diào)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示XBP-1和GAPDH可在相應(yīng)的位置見單一條帶，見圖1A。同時XBP-1與GAPDH的熔解曲線均為單一的尖峰，證明我們所建立的體系能夠特異地擴(kuò)增目的基因，見圖1B。使用2-ΔΔCt法分析顯示，腫瘤組織中XBP-1的mRNA 表達(dá)量相對于癌旁組織而言明顯降低，僅為癌旁組織的0.439(P<0.01)，見圖1C。

Figure 1.The expression of XBP-1 in human gastric cancer and paracancerous tissues at mRNA and protein levels. A: XBP-1 mRNA expression (L1～L8: paracancerous 1, tumor 1, paracancerous 2, tumor 2, paracancerous 3, tumor 3, paracancerous 4 and tumor 4, respectively); B: melting curve (*: GAPDH; **: XBP-1); C: the mRNA expression of XBP-1 was detected with real-time PCR. Mean±SD. n=20. ##P<0.01 vs paracancerous.

2 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃癌組織中XBP-1蛋白的表達(dá)下調(diào)

胃癌組織中XBP-1蛋白的表達(dá)水平顯著低于與其配對的癌旁組織(P<0.01)，總趨勢與mRNA的表達(dá)情況相一致，見圖2A。

3 免疫組化結(jié)果表明XBP-1蛋白在胃癌組織中表達(dá)下降

免疫組化結(jié)果顯示在癌旁組織中，XBP-1主要表達(dá)在胃底腺壁細(xì)胞中，且染色呈強(qiáng)陽性，為棕褐色顆粒狀，然而，在腫瘤組織中，XBP-1的表達(dá)顯著降低甚至不表達(dá)。半定量分析免疫組化結(jié)果可見，XBP-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.01)，與real-time PCR及Western blot的結(jié)果一致，見圖2B。同時通過對染色部位的分別統(tǒng)計，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中XBP-1蛋白表達(dá)的平均吸光度分別為0.225和0.141，其在胞核中的表達(dá)明顯高于胞質(zhì)(P<0.01)。

Figure 2.The protein expression of XBP-1 in the gastric cancer and paracancerous tissues detected by Western blot (A) and immunohistochemical staining (B, ×400). L1～L6: paracancerous 1, tumor1, paracancerous 2, tumor 2, paracancerous 3 and tumor 3, respectively. The Western blot images of XBP-1 showed two nearby bands, standing for its two isoforms, XBP-1U and XBP-1S. B1: paracancerous gastric tissue; B2: well differentiated tumor; B3: moderately differentiated tumor; B4: poorly differentiated tumor. Mean±SD.n=24 in A; n=48 in B. ##P<0.01 vs paracancerous.

4 XBP-1蛋白表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

臨床資料顯示，XBP-1的表達(dá)水平與腫瘤分化程度有關(guān)，低分化或未分化的胃癌組織XBP-1蛋白表達(dá)水平相比中、高分化的組織顯著降低(P<0.01)；XBP-1的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和癌胚抗原等未見顯著相關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 48例胃癌組織中XBP-1蛋白表達(dá)水平與臨床相關(guān)性分析

5 腫瘤組織中XBP-1表達(dá)水平與胃癌預(yù)后的相關(guān)性

根據(jù)成對的腫瘤組織和癌旁組織中XBP-1蛋白的平均吸光度值，將相對值≥1/3的樣本設(shè)為高表達(dá)組，而相對值<1/3的樣本設(shè)為低表達(dá)組(腫瘤vs癌旁組織)，以Kaplan-Meier法對2組生存情況進(jìn)行3年生存率分析，并使用log-rank檢驗(yàn)對生存曲線的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。Kaplan-Meier生存分析表明，高表達(dá)組相對低表達(dá)組而言有明顯的生存延長，表明XBP-1高表達(dá)的胃癌患者手術(shù)預(yù)后情況更優(yōu)(P=0.007)，見圖3。因此，XBP-1可能是影響胃癌患者術(shù)后生存率的獨(dú)立參考因素。

Figure 3.The survival curves for the patients with high and low expression of XBP-1 determined by immunohistoche-mistry.

討 論

XBP-1蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應(yīng)激反應(yīng)和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)緊密相關(guān)，具有調(diào)節(jié)、控制免疫功能和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)基因的作用[10-11]。在分子生物學(xué)中， 轉(zhuǎn)錄因子是一類通過與特定DNA序列結(jié)合，激活或抑制下游基因，從而將遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)錄到信使RNA的過程的蛋白質(zhì)[12]。有研究指出，轉(zhuǎn)錄因子具有MHC II類基因調(diào)控漿細(xì)胞分化，嗜酸性粒細(xì)胞分化，血管生成，病毒復(fù)制及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等功能。XBP-1還可能與阿爾茨海默病和克羅恩病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13-14]。

我們通過免疫組織化學(xué)，Western blot法和real-time PCR方法分別檢測了XBP-1的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中XBP-1下調(diào)。免疫組化結(jié)果提示XBP-1蛋白主要表達(dá)在胃癌細(xì)胞的胞核中，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯低于核中的表達(dá)。與大多數(shù)其他基因在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄生成mRNA不同的是，XBP-1的mRNA剪接發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，稱為細(xì)胞質(zhì)剪接，即為XBP-1U剪接生成XBP-1S的過程[15]。在這種情況下，可以解釋為何在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有XBP-1表達(dá)但表達(dá)水平有明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)XBP-1在胃組織中的細(xì)胞定位似乎位于壁細(xì)胞中。在胃底腺中主細(xì)胞和壁細(xì)胞占細(xì)胞的多數(shù)，而不同于主細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞，壁細(xì)胞具有更多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。XBP-1參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的這一功能，在結(jié)構(gòu)和功能相統(tǒng)一的角度上解釋了其在生物學(xué)定位上表達(dá)于壁細(xì)胞中的原因。生存分析顯示XBP-1與胃癌的預(yù)后顯著相關(guān)。低表達(dá)水平反而預(yù)后較不樂觀。臨床病理特征分析表明，盡管XBP-1表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期及常見腫瘤標(biāo)志物CEA的臨床病理特征無關(guān)，但提示XBP-1表達(dá)與分化程度呈正相關(guān)，在高分化、中分化和低分化的胃癌組織中，XBP-1的表達(dá)依次降低。病理分化程度是反映腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)，XBP-1表達(dá)水平與分化程度的關(guān)系提示了XBP-1表達(dá)的下調(diào)可能提示更具侵襲性的胃癌表型。

據(jù)報道有2種不同的XBP-1亞型，在UPR刺激下的非常規(guī)剪接將未剪接的XBP-1U的mRNA轉(zhuǎn)化為剪接的XBP-1S[7]。而這2種亞型可能具有截然相反的生物學(xué)功能，將分別導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或存活。XBP-1U可能上調(diào)過氧化氫酶的表達(dá)，而XBP-1S的作用則相反[16]。一些研究表明XBP-1S的上調(diào)可以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[11,17]。研究還表明，XBP-1U促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反應(yīng)在臨床隨訪上即具有良好的預(yù)后，而XBP-1S有利于腫瘤細(xì)胞存活，并與內(nèi)分泌抵抗和不良預(yù)后相關(guān)[7]，其促癌的機(jī)制可能和XBP-1S通過負(fù)調(diào)控抑癌基因TAp73的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)[18]。因此我們推斷XBP-1在胃癌中的下調(diào)機(jī)制可能與XBP-1U/XBP-1S的比例失調(diào)有一定關(guān)系。這2種亞型在胃癌中的表達(dá)情況與相互關(guān)系可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制密切相關(guān)，值得進(jìn)一步的研究。

總之，作為一個潛在的腫瘤抑制因子，XBP-1基因在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用，其在胃癌腫瘤組織中蛋白與基因表達(dá)水平及臨床相關(guān)分析的特點(diǎn)可為進(jìn)一步研究胃癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子XBP-1發(fā)揮抑癌效應(yīng)及機(jī)制提供依據(jù)。為胃癌的未來治療和預(yù)后評估提供新的臨床輔助指標(biāo)。