王天爽， 張 靜， 任雅麗， 常杏芝△

(北京大學第一醫(yī)院 1兒科, 2電鏡室， 北京 100034)

骨骼肌雷諾丁受體1(ryanodine receptor 1，RYR1)基因編碼的RyR1蛋白是骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的鈣通道，參與骨骼肌的興奮收縮偶聯(lián)。RYR1突變是最常見的先天性肌病中央軸空病(central core disease，CCD)最主要的致病原因。中央軸空病特征性的病理改變?yōu)榧±w維在氧化酶染色時存在不著色的軸空樣區(qū)域，超微病理檢查發(fā)現(xiàn)軸空區(qū)域內(nèi)線粒體明顯減少或缺失[1]。RYR1突變導致肌纖維軸空區(qū)域內(nèi)線粒體缺失的發(fā)病機制尚不明確。線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)的最重要的蛋白之一[2]，受上游過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子 1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PGC- 1α)蛋白的調(diào)控[3]。Mfn2的N端有Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠調(diào)節(jié)Ras相關(guān)信號通路，如Mfn2可以與Ras結(jié)合后抑制其活化，進而抑制Ras介導下游細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)氧化應激通路的激活[4]。有文獻報道ERK1/2通路參與了RYR1突變所致的疾病發(fā)生過程[5]。因此，推測Mfn2及其下游相關(guān)氧化應激通路參與了RYR1突變所致骨骼肌內(nèi)線粒體缺失的發(fā)生。本研究中，我們采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)敲減小鼠成肌細胞C2C12中RYR1的表達，觀察線粒體數(shù)目及形態(tài)的改變，以及PGC-1α、Mfn2及其下游信號通路的標志分子ERK1/2及其磷酸化蛋白的變化，探討RYR1表達下調(diào)對于線粒體形態(tài)和數(shù)目的影響及其機制。

材 料 和 方 法

1 主要實驗材料、儀器和試劑

小鼠成肌細胞系C2C12購自國家實驗細胞資源共享平臺。Olympus光學顯微鏡(Olympus)；透射電子顯微鏡(JEOL-1230)；ABI 7500 Real-Time PCR System和Power SYBR Green PCR試劑盒(Life)。PGC-1α抗體和Mfn2抗體(Abcam)；ERK1/2抗體和p-ERK1/2抗體(Cell Signaling Technology)；GAPDH抗體、山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標記和山羊抗小鼠IgG/辣根過氧化物酶標記(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；化學發(fā)光液(Thermo)；TRIzol reagent、Lipofectamine 3000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1siRNA設計合成 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取小鼠RYR1編碼序列(Gene ID: 20190;mRNA：NM_009109.2)，由北京柏林羅核酸技術(shù)有限公司合成RYR1干擾序列RYR1-siRNA(5’-GCGAUGAUCUCUAUUCUUATT-3’)和非靶向的陰性對照序列NC-siRNA(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)。

2.2實驗分組 本實驗分3組，即RYR1敲減(knock-down，KD)組和陰性對照(negative control，NC)組及空白對照(blank control，BC)組。

2.3C2C12細胞的培養(yǎng)方法 C2C12細胞常規(guī)培養(yǎng)于生長培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)中，誘導分化時換為分化培養(yǎng)基(DMEM+2%馬血清+1%雙抗)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h鋪板，C2C12細胞按照每孔5×105的密度接種于6孔板中，當細胞生長至70%時，分別轉(zhuǎn)染RYR1-siRNA和NC-siRNA。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h后換分化培養(yǎng)基誘導細胞分化為骨骼肌細胞，誘導5 d后收集細胞。

2.5C2C12細胞的電鏡標本制備和圖片攝取 收集細胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心4 min，棄上清，加入2 mL PBS重懸，吹打清洗，收集于2 mL離心管中。再次3 000 r/min離心10 min，棄上清，重復上述步驟2次后，棄上清，沿離心管側(cè)壁緩緩加入1%戊二醛固定液1.5 mL，4 ℃固定2 h以上，送北京大學第一醫(yī)院電鏡室進行標本處理和制備。在透射電子顯微鏡(JEOL-1230)下，設置放大倍數(shù)為20 000倍，選擇反差效果好、無污染及損壞的部位，隨機選取視野進行拍照，每例標本拍攝不少于10張照片且拍攝的線粒體總數(shù)不少于100個。每組獨立重復6次實驗，每組拍攝照片不少于60張。

2.6線粒體體視學分析 將電鏡照片輸入圖像分析軟件(Analysis Image Processing)中，將每張圖片中的線粒體輪廓勾勒出來，計數(shù)線粒體的數(shù)目，并測量線粒體的面積、周長、形狀因子和最大長寬比。

2.7Real-time PCR檢測C2C12細胞內(nèi)RYR1、PGC-1α、Mfn2、ERK1/2和GAPDH的mRNA表達 根據(jù)real-time PCR引物合成要求，使用Primer 3軟件進行引物設計，由天一輝遠生物科技有限公司合成。Real-time PCR所用引物序列見表1。采用TRIzol法進行C2C12細胞的RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件設置為25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。Real-time PCR條件設置為: 95 ℃ 10 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。熔解曲線條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。結(jié)果用2-ΔΔCt法進行計算。

表1 Real-time PCR所用引物序列

2.8Western blot法檢測PGC-1α、Mfn2、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH的蛋白水平 利用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、 I 抗4 ℃孵育過夜、 II 抗室溫孵育1 h后化學發(fā)光。應用ImageJ分析軟件分析條帶光密度值，結(jié)果用GAPDH進行校正。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行處理。結(jié)果用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間兩兩比較采用Tukey檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 siRNA轉(zhuǎn)染后RYR1 mRNA表達的改變

Real-time PCR檢測RYR1的mRNA表達，結(jié)果顯示NC組與BC組RYR1的mRNA水平差異無統(tǒng)計學顯著性，而KD組RYR1的mRNA表達較NC組明顯下降(P<0.01)，敲減效率約為70%,見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of RYR1 in the C2C12 cells. Mean±SEM. n=8. **P<0.01 vs NC group.

2 C2C12細胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

電鏡下，可見NC組及BC組的線粒體表現(xiàn)為長管狀結(jié)構(gòu)，而KD組C2C12細胞內(nèi)線粒體呈明顯碎片化改變，見圖2。線粒體體視學分析結(jié)果顯示，NC組與BC組在線粒體數(shù)目、面積、周長、形狀因子及最大長寬比等方面，差異無統(tǒng)計學顯著性。與NC組相比，KD組線粒體數(shù)目呈增加的趨勢，但差異并無統(tǒng)計學顯著性；線粒體面積和周長均顯著減少(P<0.05)，而線粒體形狀因子和最大長寬比兩組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見表2。

Figure 2.The changes of mitochondrial ultrastructure of the C2C12 cells in KD, NC and BC groups. Scale bar=0.5 μm.

表2 線粒體數(shù)目及形態(tài)學指標的比較

3 PGC-1α、Mfn2和ERK1/2的mRNA表達水平的變化

Real-time PCR結(jié)果顯示NC組與BC組PGC-1α、Mfn2、ERK1和ERK2的mRNA水平的表達差異無統(tǒng)計學顯著性；而KD組PGC-1α和Mfn2的mRNA水平較NC組顯著降低(P<0.01)，ERK1和ERK2的mRNA水平與NC組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of PGC-1α, Mfn2, ERK1 and ERK2 in the C2C12 cells. Mean±SEM. n=8. **P<0.01 vs NC group.

4 PGC-1α、Mfn2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平的變化

與BC組相比，NC組PGC-1α、Mfn2、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平無明顯改變。KD組的Mfn2蛋白水平較NC組顯著降低(P<0.01)，但PGC-1α的蛋白水平在2組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性；ERK1/2總蛋白和磷酸化蛋白水平在KD組和NC組間的差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

Figure 4.The protein levels of PGC-1α, Mfn2, ERK1/2 and p-ERK1/2 in the C2C12 cells. Mean±SEM. n=8. **P<0.01 vs NC group.

討 論

臨床和動物實驗均表明，RYR1變異除了導致肌纖維形態(tài)改變，還影響骨骼肌內(nèi)線粒體的形態(tài)和功能。RYR1變異最主要的臨床表型為中央軸空病。超微病理檢查發(fā)現(xiàn)患者骨骼肌的軸空區(qū)域內(nèi)線粒體數(shù)目顯著減少或缺失[6]。在動物模型中，RyR1敲除純合突變小鼠的骨骼肌形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)顯示肌纖維減少、變細、且破壞嚴重，常在胚胎期或出生后不久即死亡[7-8]，雜合突變的小鼠也可見不同程度的肌纖維破壞及線粒體改變[9-11]。RYR1編碼的RyR1 蛋白是一種四聚體鈣離子通道，主要分布于骨骼肌細胞的終末池，參與調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放。目前認為RYR1突變導致CCD的可能機制主要有鈣離子泄漏和興奮收縮解耦聯(lián)兩種，其中鈣離子泄漏多由RyR1蛋白N端突變引起RyR1持續(xù)開放所致，由于肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子持續(xù)外流，導致細胞鈣超載，繼發(fā)線粒體損傷和細胞凋亡；而RyR1蛋白C端突變則引起RyR1功能下調(diào)，興奮收縮解耦聯(lián)，不伴隨細胞內(nèi)鈣離子水平的改變[12]，其導致線粒體損傷的機制尚不明確。

本研究采用siRNA敲低RYR1轉(zhuǎn)錄水平的表達后，可見細胞內(nèi)線粒體形態(tài)呈碎片樣改變，再次從細胞層面證實RYR1低表達對線粒體形態(tài)的影響，與既往文獻報道觀點一致。與既往觀察不同的是，本研究觀察中發(fā)現(xiàn)，線粒體數(shù)目有增多趨勢，未達顯著水平，但線粒體周長和面積顯著減少。推測碎片化傾向的線粒體可能通過某種途徑正在被清除，導致線粒體總體周長和面積還是顯著減少的。因此，我們的觀察表明，RYR1低表達對線粒體的總體影響是破壞增加。由于線粒體膜是細胞進行能量代謝和其它生物學功能的重要場所，線粒體周長和面積的顯著減少可能會影響線粒體功能。

線粒體是不斷動態(tài)變化的細胞器，多種蛋白參與線粒體的融合、分裂過程，維持體內(nèi)線粒體的動態(tài)平衡[13-14]，其中，位于線粒體外膜和肌漿網(wǎng)連接處的Mfn2，介導線粒體與肌漿網(wǎng)及線粒體之間外膜的融合。線粒體的融合有助于物質(zhì)交換，包括線粒體DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和代謝物等，維持線粒體的形態(tài)和功能[15]。Mfn2可以提高線粒體膜電位，促進葡萄糖有氧代謝，減小線粒體膜空隙及維持線粒體動態(tài)運動等[16]。研究顯示運動訓練后，骨骼肌中線粒體體積、數(shù)量和密度顯著增高，線粒體融合增多[17]，伴隨Mfn2及其上游調(diào)節(jié)因子PGC-1α表達升高[18]。Ainbinder等[19]研究發(fā)現(xiàn)，采用siRNA抑制小鼠趾短屈肌細胞內(nèi)Mfn2的表達后，細胞中線粒體分布異常伴碎片化改變，鈣離子內(nèi)流減少。而敲除Mfn2后，骨骼肌中呼吸鏈復合物功能下降，骨骼肌運動耐力降低[20]；線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的正常連接被打破，繼發(fā)細胞內(nèi)鈣離子紊亂[21]。本研究結(jié)果顯示，敲低組中Mfn2在mRNA水平和蛋白水平的表達均顯著減低，同時伴隨線粒體形態(tài)學的異常，提示Mfn2可能參與了RYR1變異所致的線粒體減少和缺失的發(fā)生。

PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生的最重要的調(diào)節(jié)因子。PGC-1α可以與雌激素相關(guān)受體α(estrogen-related receptor α, ERRα)協(xié)同作用，促進Mfn2基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)控Mfn2的表達，進而調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)和功能[22]。暴露于寒冷情況下或體育訓練可以提高組織內(nèi)PGC-1α的表達，上調(diào)Mfn2的表達，促進線粒體體積增大，抑制線粒體自噬[3]。而PGC-1α表達下降及其本身乙酰化修飾后，Mfn2表達下調(diào)，線粒體穩(wěn)態(tài)被破壞[23]。而在本研究中，敲低組細胞內(nèi)PGC-1α的mRNA水平明顯降低，但蛋白水平未見顯著變化，提示在RYR1低表達的C2C12細胞內(nèi)線粒體形態(tài)異常的發(fā)生過程中，PGC-1α可能不起主要作用，或者還存在PGC-1α轉(zhuǎn)錄后的其它調(diào)控機制。

有研究表明氧化應激反應參與了RYR1相關(guān)肌病的發(fā)生[24]。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要來源，反之，氧化應激也是導致線粒體損傷的重要原因之一[25]。Filipova等[26]對RYR1敲除的胎鼠骨骼肌進行RNA seq檢測，發(fā)現(xiàn)存在ERK1/2通路表達的異常。Giulivi等[5]發(fā)現(xiàn)RYR1基因R163C雜合突變小鼠的骨骼肌內(nèi)H2O2生成增加伴隨磷酸化ERK1/2表達升高，提示ERK1/2氧化應激通路參與了RYR1突變所致的疾病發(fā)生過程。Mfn2蛋白N端存在Ras結(jié)合位點，能夠與Ras結(jié)合后抑制其活化，進而使其下游信號蛋白ERK1/2失活，減輕氧化應激對線粒體和細胞的損傷[4]。但是，本研究中未發(fā)現(xiàn)敲低組ERK1/2的激活，提示在RYR1低表達的C2C12細胞中，ERK1/2介導的氧化應激反應可能不是導致線粒體形態(tài)學異常的主要途徑，有待進一步研究其它可能的發(fā)生機制。

綜上所述，本研究通過敲低C2C12細胞中RYR1轉(zhuǎn)錄水平的表達，探討了RYR1低表達對線粒體數(shù)目和形態(tài)學改變及其可能的發(fā)生機制。研究初步發(fā)現(xiàn)RYR1低表達導致線粒體呈碎片化改變傾向，體視學分析顯示線粒體面積和周長顯著減少。Mfn2表達顯著降低，可能參與了RYR1變異所致線粒體異常的發(fā)生，PGC-1α的調(diào)節(jié)及ERK1/2相關(guān)的氧化應激反應在此過程中可能并不發(fā)揮重要作用。RYR1變異所致線粒體異常的具體發(fā)生機制尚待進一步研究。