趙彬，唐強(qiáng)，朱路文，王艷，梁碧瑩

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市 150040

圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是新生兒死亡的主要原因，存活下來的新生兒也往往遺留運(yùn)動障礙、認(rèn)知障礙和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給家庭和社會造成極大負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)國外統(tǒng)計[2]，一半以上的患兒存在神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。越早對HIBD 患兒進(jìn)行治療，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙嚴(yán)重程度越低，患兒的運(yùn)動和認(rèn)知功能也會越早提高[3]。

早期干預(yù)中，豐富環(huán)境刺激最為常見和有效，包括視聽覺刺激和嬰兒撫觸。美國Hebb[4]最早對豐富環(huán)境進(jìn)行報道，此后在動物神經(jīng)可塑性領(lǐng)域被大量研究和應(yīng)用。在形態(tài)學(xué)(如腦皮質(zhì)厚度的變化)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建，神經(jīng)元及其樹突、軸突再生，新突觸連接形成和重塑等方面，豐富環(huán)境對非新生動物起顯著作用[5]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)[6-10]，豐富環(huán)境對HIBD 的運(yùn)動、記憶能力和空間認(rèn)知等都有改善作用，同時海馬CA1區(qū)微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein-2,MAP-2)陽性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)表達(dá)增加，還增加海馬區(qū)樹突棘的密度，促進(jìn)內(nèi)源性血管生成。已有研究提出[11-12]，損傷后發(fā)揮神經(jīng)元的保護(hù)作用，防止神經(jīng)元的變性和壞死與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受體(tyrosine kinase receptor B,TrkB)信號通路相關(guān)。HIBD 發(fā)生后細(xì)胞變性壞死主要是通過細(xì)胞凋亡的形式發(fā)生，因此對細(xì)胞凋亡的通路和機(jī)制進(jìn)行研究，找到抗凋亡的新方法成為目前研究的關(guān)鍵問題。

本實驗通過建立HIBD 大鼠模型，探討豐富環(huán)境對海馬神經(jīng)元凋亡及BDNF/TrkB信號通路的影響，并探討可能作用機(jī)制，為臨床HIBD 治療提供有力證據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48 只7 日齡新生Wistar 大鼠幼仔，體質(zhì)量(12.5±0.7)g，雌雄比例1∶1，按照科技部《實驗動物管理條例》進(jìn)行飼養(yǎng)。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、假手術(shù)組和豐富環(huán)境組，每組再分為14 d、28 d兩個亞組，每個亞組8只。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑

水合氯醛：天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司。4%多聚甲醛：武漢博士德公司。濃縮型BDA 試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蛋白酶k：上海如吉生物技術(shù)有限公司。BDNF 一抗：沈陽萬類生物科技有限公司。TrkB一抗：武漢博士德公司。一抗二抗去除液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PVDF 膜：美國MILLIPORE 公司。脫脂奶粉：伊利。兔抗大鼠多克隆抗體：北京博奧森公司。

1.2.2 儀器

RM2265 型全自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：德國LEICA 公司。Eppendorf Researchplus 移液器：德國EPPENDORF 公司。H-2050R 型超高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。CX31 型生物顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。W1OLVF 超純水系統(tǒng)：香港HEALFORCE 公司。DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒儀器有限公司。8%O2+92%N2混合氣體：哈爾濱黎明氣體集團(tuán)。

1.3 模型制作

新生大鼠HIBD 模型制備采用Rice-vannucci 經(jīng)典方法，新生Wistar 大鼠10%水合氯醛0.3 g/kg 麻醉，常規(guī)消毒后頸正中切口，將左側(cè)頸總動脈分離，永久性結(jié)扎，對合皮膚后縫合。術(shù)后2 h 置于含8%O2+92%N2有機(jī)玻璃缺氧箱中缺氧2 h，同時記錄新生鼠一般行為。大鼠出現(xiàn)夾尾尖叫或者自發(fā)向左轉(zhuǎn)圈，說明模型制備成功，將其重新放回籠中繼續(xù)由母鼠進(jìn)行母乳喂養(yǎng)。

假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎和缺氧，隨后放入原籠中母乳喂養(yǎng)。

1.4 建立豐富環(huán)境刺激模型

制作70×60×50 cm 的透明玻璃環(huán)境[13]。此環(huán)境中擺放不同顏色、氣味和形狀的物品，包括各種質(zhì)感的紗布、刷子，低溫物品和有刺激性氣味的菠蘿干、榴蓮球等，還有積木、塑料通道、樓梯、繩子、蹺蹺板、松土盒、玻璃球等“玩具”，同時用紅色燈光刺激活動區(qū)，在玻璃籠中用音樂盒播放音樂進(jìn)行聲音刺激，考慮到大鼠的晝息夜出習(xí)慣、生存溫度、攝食等因素，3 d后對環(huán)境進(jìn)行重新布置。

1.5 干預(yù)方法

假手術(shù)組和模型組術(shù)后24 h 置于無任何刺激籠中飼養(yǎng)，保持籠中清潔，大鼠正常攝食、飲水等，予以同等條件抓取。

術(shù)后24 h，豐富環(huán)境組每天與母鼠分離4 次，每次30 min，放入豐富環(huán)境籠，進(jìn)行早期撫觸和視聽覺刺激，氣味和不同溫度刺激。

1.6 檢測

各組于造模后14 d、28 d，10%水合氯醛0.3 g/kg麻醉后，常規(guī)消毒腹腔開口，破壞膈肌造成氣胸，暴露心臟，右心耳開口，將0.9%氯化鈉注射液100 ml及4%多聚甲醛溶液灌入，觀察肺部和肝臟呈現(xiàn)白色，期間大鼠可出現(xiàn)四肢抽搐最后僵直狀態(tài)。迅速切頭后取腦，分離海馬，將分離的海馬浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，48 h 后乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，厚3～5 μm。

1.6.1 TUNEL法

每只大鼠隨機(jī)選取5 張切片，烤片、脫蠟、乙醇水合后，蛋白酶k 常溫下消化30 min，PBS 漂洗液3次，加入TUNEL 反應(yīng)液，37 ℃暗溫盒中放置60 min。熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、乙醇脫水、二甲苯透明封片、鏡檢、拍照。每張切片選取5 個不重復(fù)視野，顯微鏡下計數(shù)TUNEL 陽性神經(jīng)元，取均數(shù)。

1.6.2 雙重免疫熒光染色法

每只大鼠隨機(jī)選取5 張切片，脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，常溫下PBS 和FBS 封存后，滴加兔抗大鼠切割半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)多克隆抗體(美國SANTA BIOTECHNOLOGY 公司)和大鼠抗神經(jīng)元特異性核蛋白抗體(1∶1000，美國CHEMICON公司)，保濕盒中4 ℃孵育12 h，PBS 洗滌3 次，滴加二抗(上海碧云天公司)室溫下孵育1 h，PBS 洗滌3 次，干燥過夜封片。每張切片取5 個不重復(fù)視野，正置熒光顯微鏡觀察，拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.6.3 免疫組化法

每只大鼠取5 張切片，60 ℃烤干、脫蠟入水，內(nèi)源性過氧化物酶活性3% H2O2溶液滅活，滴加一抗(BDNF 或TrkB)，4 ℃過夜(陰性對照用PBS 代替)，隔日以室溫恢復(fù)，滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育10～15 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～15 min；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，分化、返藍(lán)、脫水、干燥，封片并拍照記錄。CX31 型顯微鏡下觀察，陽性以棕黃色或棕褐色呈現(xiàn)，陰性細(xì)胞以藍(lán)色呈現(xiàn)。每張切片取5 個不重復(fù)視野，記錄視野內(nèi)BDNF、TrkB陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元凋亡

2.1.1 TUNEL法

造模后14 d、28 d，與假手術(shù)組比較，模型組海馬區(qū)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，豐富環(huán)境組海馬區(qū)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.001)。見圖1、表1。

2.1.2 雙重免疫熒光染色

造模后14 d、28 d，與假手術(shù)組比較，模型組雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，豐富環(huán)境組雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.001)。見圖2、表2。

2.2 海馬BDNF表達(dá)

造模后14 d、28 d 后，假手術(shù)組海馬BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)不明顯；與假手術(shù)組比較，模型組海馬BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增高(P<0.001)；與模型組比較，造模后28 d，豐富環(huán)境組海馬BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增加(P<0.001)。見圖3、表3。

表1 各組造模后14 d、28 d后海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(n/視野)

圖1 各組造模后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

圖2 各組造模后神經(jīng)元表達(dá)(雙重免疫熒光染色，×800，bar=100 μm)

表2 各組造模14 d、28 d后海馬區(qū)雙重免疫熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)(n/視野)

表3 各組造模14 d和28 d后海馬BDNF陽性細(xì)胞計數(shù)(n/視野)

2.3 海馬TrkB表達(dá)

造模后14 d、28 d，假手術(shù)組海馬TrkB 陽性細(xì)胞表達(dá)不明顯；與假手術(shù)組比較，模型組海馬TrkB 陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增高(P<0.001)；與模型組比較，造模后28 d，豐富環(huán)境組海馬TrkB 陽性細(xì)胞顯著增加(P<0.001)。見圖4、表4。

表4 各組造模14 d和28 d后海馬TrkB陽性細(xì)胞計數(shù)(n/視野)

3 討論

新生兒HIBD 主要由圍產(chǎn)期宮內(nèi)病理因素和窒息引起，可以造成新生兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[13]。豐富環(huán)境刺激通過顏色視覺刺激，接觸物觸覺刺激，滾筒、臺階、秋千等的平衡刺激，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育，提高認(rèn)知功能[14]。豐富環(huán)境干預(yù)不僅可以使神經(jīng)突觸可塑性增強(qiáng)，還可以調(diào)控營養(yǎng)因子和再生因子濃度[15-16]，其中BDNF激活釋放以及與特異性受體TrkB結(jié)合使神經(jīng)再生，細(xì)胞間突觸重建或重組，減輕腦損傷[17]。當(dāng)TrkB 與BDNF特異性結(jié)合后，激活產(chǎn)生復(fù)合物，產(chǎn)生某些小G 蛋白，包括Ras 蛋白和Rap-1 等[18]。李亞琴等[19]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射BDNF 后HIBD 小鼠腦內(nèi)TrkB mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，對腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)作用明顯強(qiáng)化。相關(guān)報道表明[20-21]，BDNF 在各種原因?qū)е碌娜毖跞毖罂梢员苊馍窠?jīng)元凋亡，預(yù)實驗顯示當(dāng)給予TrkB 受體的選擇性激動劑29d7 處理后神經(jīng)元的存活能力顯著增加。當(dāng)BDNF 與全長型的TrkB 受體結(jié)合，BDNF/TrkB 信號通路才能被激活，BDNF/TrkB 信號通路激活后可以改善神經(jīng)功能，減少梗死體積以及修復(fù)受損神經(jīng)元[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模28 d后，豐富環(huán)境組海馬BDNF和TrkB表達(dá)高于模型組。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)BDNF細(xì)胞表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖4 各組大鼠海馬區(qū)Trkb細(xì)胞表達(dá)(免疫組化染色，×400)

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的一系列介導(dǎo)、調(diào)控并且有程序性和主動性細(xì)胞死亡過程。凋亡和調(diào)控的對抗決定細(xì)胞最終的結(jié)果。在有限的“時間窗”內(nèi)有效調(diào)控細(xì)胞的凋亡信號能大大保留神經(jīng)功能。徐曉虹等[23]研究發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)可抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抵抗缺血再灌注損傷，認(rèn)為豐富環(huán)境是抗細(xì)胞凋亡、改善腦功能的一條有效途徑。本實驗應(yīng)用TUNEL 法和雙重?zé)晒馊旧珜ι窠?jīng)元內(nèi)細(xì)胞凋亡標(biāo)記物cleaved caspase-3 和成熟神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN 進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示，各時間點(diǎn)豐富環(huán)境組雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)少于模型組。說明細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在神經(jīng)元內(nèi)，豐富環(huán)境是通過調(diào)控海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡來抑制腦組織損傷。

綜上所述，豐富環(huán)境在新生兒HIBD 后上調(diào)BDNF、TrkB 蛋白的表達(dá)，抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)、修復(fù)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡，改善腦功能的作用。但新生兒HIBD 是個復(fù)雜的過程，其下游通路和信號及蛋白表達(dá)還需進(jìn)一步探究。